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标题:[求助]关于MTT测药物半抑制率的困惑

dotaaa[使用道具]
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我刚刚开始培养细胞,所以有很多问题搞不懂,请楼上的各位前辈指点一下:一些文献上说要把细胞数控制在105/ml,但也有文献说是105/孔,所以搞不清楚到底是以孔为单位还是以ml为单位呢?
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one[使用道具]
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应该是把细胞数控制在105/ml,铺板时每孔100ul即104/ml。
这是指一般情况,具体铺细胞时应根据自身细胞的增殖速度、细胞个体大小等调整细胞数,有4000/孔的,也有20000/孔的,只要最后的测量数据在线性范围中就行。
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wu11998866[使用道具]
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MTT时一般以490nm为检测波长,570nm为参考波长,不可以通用。
原理是:
在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长,在此波长下,此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段,就会造成检测结果的不准确。因此,在测定检测物时,我们选择特定的波长进行检测,称为测量波长MTT时为490nm。
但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收,为了消除这种非特异性吸收,我们再选取一个参照波长,以消除这个不准确性。在参照波长下,检测物光的吸收最小,MTT时为570nm。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。
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yychen[使用道具]
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MTT时一般以490nm为检测波长,570nm为参考波长,不可以通用。
原理是:
在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长,在此波长下,此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段,就会造成检测结果的不准确。因此,在测定检测物时,我们选择特定的波长进行检测,称为测量波长MTT时为490nm。
但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收,为了消除这种非特异性吸收,我们再选取一个参照波长,以消除这个不准确性。在参照波长下,检测物光的吸收最小,MTT时为570nm。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

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您说570nm时formazan(MTT被还原的产物)对光的吸收最小是错误的哦,相反,570nm时其光吸收值最大,所以用570nm做MTT的检测波长是最好的。请看我发的图片,实线为formazan的吸收光谱,虚线为MTT原液的光谱。


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2011-12-16 17:38
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+小生怕怕+[使用道具]
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如果仪器上只能测405,490,和550,655
这个没有570啊

是否是选择550比较合适?
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yychen[使用道具]
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回复 #31 +小生怕怕+ 的帖子

我觉得550比较合适,这时候测出的OD值总体会比490nm时测得的高。对于毒蛇同志提到的参照波长,应该取655nm。因为由图可见,655nm时formazan对光的吸收值小于0.1。
我找到一篇参考文献:华东理工大学学报(自然科学版);2000 Vol.26 No.1 P.103-106;MTT法测定人表皮癌细胞的抗药性;钱江潮。
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其实选择波长的关键不一定是要值最高,象favoritevirus提供的扫描图中490-600间都可用作MTT测量的波长,只要在此波长下,测量值与你的测量范围中的细胞数间呈线性关系即可。所以说有时当值普遍高出测量范围显不出差异时甚至可以通过调节波长而得到较好的结果。
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dragonkilly[使用道具]
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其实选择波长的关键不一定是要值最高,象favoritevirus提供的扫描图中490-600间都可用作MTT测量的波长,只要在此波长下,测量值与你的测量范围中的细胞数间呈线性关系即可。所以说有时当值普遍高出测量范围显不出差异时甚至可以通过调节波长而得到较好的结果。

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是的,个人觉得这个解释是比较中肯的,所有的波长选择,不应该在乎它是峰值与否,关键能和你所设定的对照显示出差别,能说明问题就是最好的.如果在你选择的波长不能很好区别样本,可以考虑在一定范围内选择其他的波长,这样的解释才是辨证而科学的思维方式.
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+小生怕怕+[使用道具]
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各位前辈,能帮我看看下面的实验数据有没有什么硬伤么??

细胞应该是混均了的。但是
1 在稍微高一点的浓度,细胞就死得光光了。例如30,24,18ug/ml.
2 在低浓度总是测得是促进细胞增长的。这不是一次实验的结果,基本上很多很多次实验都是这样的一个问题。
呜呜呜呜,就是我找不到在低浓度6ug/ml 的时候OD值竟然比对照还高的原因。

已经做过很多此预实验了,下面的情况每次都有,大家可以提点意见么?

药物浓度   30ug/ml 24.000 18.000 12.000 6.000 对照

复孔1   0.062 0.019 0.015    0.631 1.460 1.092
复孔2    -0.011 -0.019 -0.026    0.689 1.286 0.904
复孔3   -0.020 0.017 0.013    0.701 1.373 1.038
复孔4   0.002 0.044 -0.023    0.581 1.152 0.851
复孔5   0.014 -0.022 -0.001    0.742 1.341 1.007

平均值   0.009 0.008 -0.004    0.669 1.322 0.978
抑制率   0.990 0.992 1.004    0.316 -0.352 0.000
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+小生怕怕+[使用道具]
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我努力了N次 ,但是排好版后在这里面显示的实验数据还是乱七八糟。晕倒了

我不知道怎么能让你们看清楚点。
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