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标题:[求助]谁能帮我看看这是不是肺泡II型上皮细胞

guagua[使用道具]
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参考一下:
肺泡Ⅱ型上皮细胞的割断面,其细胞质内有线粒体(M)、粗面内质网(RER)及板层体(LB)等细胞器。Mv为Ⅱ型细胞游离面之微绒毛,L为肺泡腔。
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hot_hot_hot[使用道具]
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我刚看到还有这么多的师兄师姐在做类似的实验。我在做类似的实验过程中发现了一个问题:就是细胞涂片加上BCIP/NBT染色时出现脱片,对照(PBS)没有脱片。不知道是什么原因?怎么解决?谢谢。
Dobbs全文好像我没搞到,谁能否给我发一份?anjh931@yahoo.com.cn,谢谢。
实验中加入DNA酶我发现很有必要的,主要作用有:
(1)减少细胞成团;
(2)可以用来粗略评估细胞消化的程度;、
对了,我还想问你们用的是什么消化酶?浓度是多少?时间以多少为合适?
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小野花[使用道具]
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回复 #12 hot_hot_hot 的帖子

我是单用0.25%胰酶,时间20分钟,不过效果还不知道怎么样呢,也想请教一下anjh931,您的BCIP/NBT试剂盒是什么厂家的,工作液怎么配的?而且这个试剂盒说需要-20度保存,需要给分装么,还是只要用时溶开,用后冻上就可以了,请赐教。
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缘yuan[使用道具]
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当然要分装~反复冻融会坏的
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小野花[使用道具]
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可是我打回厂家,那里的人说应该可以,说只要不是酶类的就应该可以,这里的负20度保存是指长期保存,不过我听口气 怀疑不是专业人士,所以不敢相信,像请教做过这个试剂盒的朋友,能帮个忙么。
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缘yuan[使用道具]
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消化的方法和程序不同的文献不完全相同。主要的是消化酶的不同。当然有弹性蛋白酶、分散酶那是最好的了。如果你的老板--建议用后两者。我在实验中0.25%和0.1%的胰酶(15-20min)我都试过,效果区别不是很大,由于目的细胞含量不多,加之没有鉴定的方法,也没有进行培养,不好评论。
对于这个实验,我有一下体会,或许对你有帮助。
(1)消化过程在倒置显微镜下观察下进行。
(2)消化时间不能太长和过于强烈,导致细胞活性下降。消化结束后去掉消化液,经FBS终止消化后,用摇床摇使目的细胞脱落下来。
(3)用胰酶浓度过大,炎性细胞的Fc受体损伤,不宜于用IgG包被的方法纯化。
(4)BCIP/NBT试剂盒(100×)我用的是中杉金桥的,按使用说明书操作,是否浓度过高是脱片的原因待排除。分装我考虑过,但量不多,不结冰,冰箱旁吸取,动作快一点,影响可能不会很大。我暂时没分装。师兄确认需要分装,不妨告诉我。谢谢
彼此交换一个经验,我们每个人都会有2个。
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小野花[使用道具]
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回复 #16 缘yuan 的帖子

我看细胞培养书上确实说用胰酶不适合用抗体包被,不过我看中国的国家自然基金的文献上也同样用胰酶和抗体包被了,所以想试试,觉得包被简单点么,如果不行只能另用它法了或者改用弹性蛋白酶,这周由于要准备科里安排的报告,所以实验没有进行上,我一定不会吝啬经验的,只可惜现在还没有做过一次完整的,我决定等我把这个细胞养成,一定从头到尾给总结出来。
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guagua[使用道具]
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其实细胞脱片的原因应该是很容易向导的,不过都被我们忽略了:
AKP的活性需要碱性条件,BCIP/NBT试剂盒(100×)提供的BufferpH9.5
用多聚赖氨酸包被的环境是酸性。
能不掉片吗?
问题是用其他的什么方法包被玻片吗?
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bamboo16[使用道具]
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呵呵,我昨天做了鉴定。由于我们这里的显微镜是绿色光,所以不能把鉴定细胞照片拍下来,这是我染色前拍的,基本都是肺泡II型上皮细胞,但是不是非常纯,大家可以看看,对照一下。


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bamboo16[使用道具]
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我也是在丁香网上得到了很多帮助,所以希望自己的一些东西可以帮助到大家。等我空下来一定告诉大家我自己的培养方案和体会。
再贴一张。


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