[讨论帖]实验室成败经验 - 经验共享

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标题:[讨论帖]实验室成败经验

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我养了四个月的鼻咽癌细胞和喉癌细胞,经验不多教训不少.跟大家尤其是将养细胞的新手分享一下:
1 有备无患新手养细胞出错是难免的,所以得先准备好退路.首先细胞旺盛的时候一定要记得冻存,最好一种细胞冻三四管,复速细胞成活率可能没书上说的那么高.其次是要跟其他养同种细胞的搞好关系,危急时候互相支援一下吃吨饭强过被老板批再花大几百去买
2 不教条主义初养细胞配液调PH值很麻烦,一般的试纸很不精确,号称精密试纸的作用也有限.我的经验是先参考说明书,按推荐剂量加.其次是观察颜色,多配几次对颜色有个印象,虽不是非常精确有大的出入还是能发现的.最后是观察培养液变黄时间,这是最重要的,我的经验是调整到两天变黄,这样工作量不是太大,营养也足够.换液时正好传代(我的细胞生长好时两天一代.强调一点注意双蒸水的PH值可能偏低,我们用的水只有6,最初没发现害人不浅
3 警惕污染细胞出现污染情况要提高警惕但不要慌张.细菌污染比较好处理,少量的用大量PBS冲洗三次加入抗生素一般可以解决.大量的就只好弃取以免养虎为患,真菌污染非常麻烦但污染较轻及时加入抗真菌药还可以挽救一些
就说这些祝各位好运!

dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也刚开始养细胞,失败的经验比较多,希望大家不要重捣我的复辙.
我培养的是晶状体上皮细胞
刚开始,我的细胞总是不长,有时候一个月才长一点点,在丁香园查看文章才知道是衣原体感染了,以后严格无菌操作细胞很快就长出来了!
后来养了几批细胞,有一批污染了没有注意,加培养液的时侯一块加,结果所有的都污染了,真事欲哭无泪阿!我的经验是应该多养几批,分开操作可以防止一块污染.

windy+++[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

养细胞快有三年了，刚开始养的是大鼠心肌细胞，我记得最多的时候一周两次，每次20-30只左右，从开始准备洗瓶子，消毒，培养，到换液，处理等，要一周时间。其中经历了细胞状态不好，污染，不搏动还有血清质量不好等很多问题。所以我觉得在养细胞前，一定要检查好培养液有无问题，如PH值，有无污染，还有血清一定要质量好的尤其是对于原代的细胞，这样有住于细胞的贴壁。胰酶我是先配成母液用前用PBS稀释，这样可以把胰酶冻在-20度冰箱里。做原代时一定按顺序放好各个物品，以防污染。
在培养293细胞时，细胞状态很不好，我用了20％血清，两天换一次液，状态逐渐好转。
后来做过人脐带的平滑肌细胞，我觉得最重要的是动脉的外膜一定要剥离干净，组织块剪的尽量小些，分布均匀一些，使组织快周围和培养瓶贴紧密，这样才有利于细胞爬出来。

盼盼[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

已经差不多养了三个月细胞了，也算小小的积累了一些经验，呵呵．
养的是hacat细胞，算是生命力比较顽强的，不容易死．
刚开始养细胞的时候，很小心，怕污染，所以细胞也一直没出什么差错，蓬勃生长．但随着时间过去，问题就越来越多了，最郁闷的一次是，养着的两瓶细胞竟然同时污染，而且污染的是不同的细菌，一瓶培养液浑浊的一塌，一瓶里面可以看看很多杆状的歪歪扭扭的细菌．很无奈，全扔了，然后复苏，结果这个细胞复苏效果特别不好（也许我冻存也没弄好），一般只有１／１０不到的细胞会活，整整长了一星期才旺盛起来．．．．

现在细胞状态又不太好了，能看到很多透明的小颗粒，不知道是什么东西，而且常常有培养瓶出现周围细胞长的很快很满，中间以及靠近瓶口处细胞很稀疏：（郁闷中．．．．）

loli[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有些超净台的前的所谓“玻璃”用的是有机玻璃材料，不是真正的玻璃，如果有机玻璃，用75％酒精擦拭，就会造成表面模糊的情况，如果是真正的玻璃，则不会发生这种情况。
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看了这么多兄弟姐妹的经验之谈，真长了不少见识．

在这里我也谈一个小事故吧，以供参考．

刚进细胞室的时候有些小的规则不知道，在收拾做实验用的东西后，我发现无菌操作台的玻璃有些脏，于是就自作主张用７５％的酒精去擦，结果傻眼了，那一点点花变成了一大片．操作台整个不能用了，因为几乎看不到里面了，只能换玻璃了．

后来师兄想了一个好方法，用牙膏擦拭，效果非常好，如果有哪位新手也遇到这个问题不妨一试．

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

去年九月开始进实验室，目标是制备单抗，养的是杂交瘤细胞，即为小鼠脾细胞与NS-1的融合细胞，是贴壁细胞，不需要消化，传代时只要轻轻吹打就可以。

首先，要调整好心态，培养细胞就如同养个小baby（前面个个人大比喻各有不同，呵呵），不可以掉以轻心，亦不可以不放在心上，很多时候心情是随着细胞的好坏变化的，这样其实很容易影响试验，只有调整好心态，以平和的态度对待，遇到问题就努力去解决，科学嘛，就是不断的出现问题解决问题，这样坚持到最后，一定可以有满意的结果。

其次，事先对你的细胞有了大致了解，在培养实战中还要不断总结，摸清你的细胞的习性，就可以轻车熟路了。如同我在拿到产抗体的细胞株后开始扩大培养，但是发现细胞已经变得有点脆弱，经不起吹打了，一吹就不再贴壁，但是换了另一个瓶子就又可以贴，所以经过摸索，我就把可以传代的细胞稍用力摇晃几下把贴的不紧的细胞摇下来，然后倒到另一个瓶子中，长势很好；或者吹了以后，转移到另外两个瓶中，丢弃以前的那个瓶子，长势也不错。呵呵，如果你也碰到这同样的情况不放试试看哦。

还有，无菌操作，培养基等前面战友已经说了很多，我也受益匪浅就不班门弄斧了， . 培养基使用前要平衡一下，室温20分钟以上或者37度10分钟以上，也不要太久，如果温度太低对细胞的刺激会很大。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一个教训大家共享
在扩大细胞的初期，我觉得细胞状态很好，就非常放心的从10％换为5％新生牛血清浓度的培养基，因为没有高糖，我想地糖应该没有问题。结果，第二天看，还没有什么变化，到了第三天，细胞就不是那么圆，那么漂亮了，我认为是营养不够了就给它换液了，再一天一看，我的妈妈呀，几乎没有活着的了。不知是什么原因，后来在与老师汇报时，忐忑不安的把过程说了一遍，结果挨了一顿训，但是知道了是因为细胞的环境改变的太快太大，导致细胞不适应了。后来啊再也不敢突然改变细胞生长环境了，要变也是一点一点慢慢的改变，呵呵－－，大家借鉴！

愿我们的试验都可以顺利进展！

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发表于 2012-1-17 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是从去年开始学习养细胞的，刚开始约有一个月的时间只是看着别人做，自己不动手，当时觉得真是太难了，好多细节都要小心，偏偏自己又是一个粗心大意的人，鼓足勇气后终于养了第一种细胞ψA，幸运的是没有污染，于是美滋滋的在镜下观察自己的细胞时骄傲的情绪上来了：养细胞挺简单的！在这种骄傲情绪的支配下，我的厄运开始了。
先是细胞状态不好，和别人的同种细胞相比，我的ψA就像林妹妹，瘦小还多颗粒，郁闷了几天后经高人指点才知道我领的血清是国产的，而我们实验室的ψA是喝进口血清长大的，我突然连招呼都不打，就给人家降低营养标准当然不行了，所以我得出的教训一：血清要换的话，要一点点地换，不要突然就换。
细胞状态好了，但却经常污染，我更郁闷，天天小心翼翼的操作还是不行，终于有一天我发现了自己的错误根源，得出了教训二：培养瓶的瓶颈处千万不能留有液体，所以操作时要小心，另外将培养瓶放到培养箱时要动作轻柔且不要倾斜。
经过了很多失败后，我终于也成为一个偶尔可以指导别人的成手了，但即使这样还会犯错误，比如紧张过度喷的酒精过多导致细胞死亡；冻存时忘记写标签；液体更换不及时；胰酶消化过度等等，诸如此类我得出的教训三：你想要细胞出什莫样的结果，取决于你如何对待它。
总之细胞的种类很多，要区别对待，这就要求我们在准备养一种细胞之前，应详细了解它的日常饮食、喜好及脾气，要像对待小孩子一样去照顾它，要经常看看它，了解它有什莫需要，当然最重要的一点是：及时把它所繁育的孩子放到液氮中保护起来。

yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

养细胞难，养原代细胞更难。刚开始做实验时，只是跟在师姐后面看看，传传递递东西。后来自己做，第一次居然养的很好，可能时看多了，步骤都烂熟于心了，当时那个兴奋阿。可是到消化细胞二次接种时，问题来了。做了几次细胞都不贴壁，基本上都漂了。问师姐，我俩的胰酶用量和消化时间都差不多。于是，干脆让师姐帮我消化一次。我看了一眼终止消化前的细胞状态，才恍然大悟：原来师姐在细胞变圆及有部分开始漂时终止消化，而我终止消化时候细胞基本全漂了。操作时间上差的很少，但就是这细微的时间差，细胞可以发生很大改变，细胞的活力受到了影响。后来，我消化细胞时不再看时间，只要镜下改变有了就终止消化，这样接种的细胞在1小时左右就贴的很好了。看来做实验不能按部就班，要从实际出发阿。

hyuu[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近又是一个失误， ,心痛了好几天啊！

虽说原因不在自己的操作，但是想起来仍是惭愧啊！

我有两株细胞，打算等到状态长得好，数量也足够的时候，冻上以留种，这样心里就会有多多安慰了，有了保证不用担心丢失了。。
在各种冻存的条件都有的那一天，我很不舒服，浑身没有力气，什么也不想做。一方面，害怕自己万一晕晕糊糊的操作失误或者其他原因导致不可挽回的错误；另一方面，自己确实那天犯懒了。。
于是呢，就决定把它们传一下。
结果，第二天一看，几乎全部死光光。呜呜－－哭都来不及了

没有办法只好面对现实，好好保护剩下的几瓶很少的细胞，等待它再次长起来。

寻找原因啊，我可以确定操作没有失误，用的也都是高压后的东西，污染应该不会。再看细胞，那天上午所有处理的细胞无一例外的变得黯淡无光，难道是培养液的问题？不可能啊，同样的培养液，额下午用来处理的细胞就安然无恙啊。再想，－－－，操净台！对就是它了。
我们实验室有两个操净台，它的紫外的开关有点不正常，有时会有你关了它却仍是开的状态，就算用前你确保它是关闭的，它也会在你用的过程中自动开启,(我已经被照过两次了，好在时间不是很久，胳膊灴了几天才好，现在，每次都把手套与隔离衣紧密连接好才进去）。而那天一定是我不知道的情况下紫外已经打开，保护好了自己，却伤害了可爱的细胞，......
后来一经交流，才知道，我不是第一个碰到这种情况的人。好在都还有幸存者（那天没有处理的），终于今天就可以冻了。欣慰啊！！

总结一下就是：1.只要你是培养细胞，就不要偷懒，哪天该做怎样的处理了，一定要坚持处理，不然，出现的意外，都是始料不及的。
2.一定注意不要让紫外与你的细胞亲密接触

呵呵，不知朋友们，有没有碰到过，最好没有，希望以后也不会，这是不是也算是，有时细胞无故状态不好，或者无故身亡的一个可能原因呢？

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