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标题:[讨论帖]实验室成败经验

lixi559[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说起来养细胞也有几年了,但总是有一种避而远之的想法,一想起天天刷瓶子,泡酸,高压灭菌,过滤......这些琐碎的事情太多,真是不想做啊
培养的细胞不算少,怎么弄怎么死不了,但是后来该养293了,细胞却如此脆弱,在拯救它的日子里,一天看3遍,随时准备换液,随时提心掉胆,真是觉得好累啊!
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

马上要毕业了，回想起来最初做实验养细胞，犯了一个低级的错误，让我郁闷了两周，是这样的：
我们科里本来养细胞的不多，那些东西都要自己准备，配试剂、配培养基、分装小牛血清，甚至包括烧三蒸水，这些东西准备了一个星期，从别的同学那里拿了一瓶细胞就开始养了，发生了一件非常奇怪的事，细胞没有污染，但是消化一次细胞就少了一部分，贴壁困难，过了好几天又消化，细胞就更少了，百思不得其解，偶然的一个机会才发现配PBS时将氯化钠拿错了，结果用氟化钠配的，所以细胞越来越少，从中得到一个教训，有时候自己犯了错误不是很容易发现。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
接着上面的话说：有一点我要提请所有养细胞的战友们注意的是，从做原代细胞培养的一开始，就必须有一个理念，那就是想着我的建系（株）会成功（这也是师兄师姐们毕业前传授的“秘笈”），其意思不是说成天想着我所建的系以后如何如何有价值（As we known，并不是每一种新建的细胞系都有很大的价值，当然这个可能还是有的），实际上是说你在从一开始做实验的时候就要想到以后建系成功后的后续实验，包括细胞系的分子标记鉴定，病毒敏感性试验，建系后的细胞与原来来源组织的差异，etc.所以说要详细记录原来取材时的材料种类，生长状况等，以便以后的实验有一个相同的标准，否则就是实验设计欠缺合理性了（严重啊，老板会骂的！）。另外，整个培养过程中要详细、客观的记录细胞的变化情况（包括文字和照片），对自己和下一届同学都是非常重要的第一手资料！一家之言，高手多多指教！
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glass[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人原是学医学的，跳槽出来进入一家生物制品研究所从事细胞培养工作，而去一做就是八年。这期间的酸甜苦辣只有自己清楚，首先是没有人教怎么进行培养，很多都是自己看书或经过大量的试验研究来获得的知识。没有学会时时常被教授骂，学会以后教授就每天都乐呵呵。哎........烦啊。现在虽然不是什么培养细胞绝顶高手，但多年来几十种细胞株在手中还没有死亡或变异过（不是吹牛啊，呵呵.........）。目前已经改行做药品研发了，但多年积累的经验希望和大家共同探讨。
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阿敏[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很感谢大家能在这里畅所欲言，但可能是我在置顶贴中没有说明白，希望这个贴子不仅仅是给大家抒发实验感想的地方，而是通过实验中所犯的一些错误和解决方法，来给其他群友们一些有宜的提示和参考，使他们能有一些捷径来快速掌握实验技能。所以，我在这里诚恳的希望后面跟贴的群友们，多谈谈实验中的技巧和注意问题，而不是自己的不断感慨，谢谢支持！
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misswu61[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养的是脂肪细胞,我要说的是前几次细胞过滤后总是有很多不明杂质,一些小的亮点.而且细胞数量特别少.不爱贴壁!!郁闷了好几天!!后来,我一个师兄,他说,过滤时不要用枪吹细胞!! 如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎!! 恍然大悟!
从中得到一个教训,做实验不要着急,要慢慢来,做仔细了,只要实验不出错,那么你就是在节省时间呢!!!
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我曾经在自己制作的无细胞真皮上养过成纤维细胞，无细胞真皮是按照文献的方法制作的，把成纤维细胞接种到无细胞真皮上的方法也是按书和文献中的方法，可是很奇怪，成纤维细胞怎么都不长，我重复了好多次，结果都是失败，后来又做了对照，同样的条件，一个平皿中直接接种成纤维细胞，另一个平皿中放入无细胞真皮，再接种成纤维细胞，结果，没有无细胞真皮的平皿中细胞长得很好，这样说明不是细胞和平皿的问题，那么问题在哪里呢？我苦思了很久，觉得是不是无细胞真皮在处理的过程中用到了一些化学药品，对细胞的生长有害，可是在接种细胞以前我已经按文献上的方法将无细胞真皮用DMEM培养液浸泡了48小时呀，在后来的实验中我就将浸泡的时间延长，并在中间每天换浸泡液一次，经过5天的浸泡以后，成纤维细胞的接种最终成功了。这份迟到的成功提醒我，对于书和文献上的东西，不能不信，也不能全信，很多东西还得靠自己在实验中摸索。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在在做双染(annexin-v/pi)和PI染色,由于所里没有FACS,做好后还要打的40min去检测,而且是按照老板在德国时用的方法和用量,结果好象还不是很好,还得自己摸浓度,做一次要老早起来,怕时间赶不上.总之感觉每做一次就要累掉一层皮,如果结果好那就什么都值得,如果不好,这一层皮就白掉了,所以感觉以前一个老师说的那句话"实验通常都是99%的失败和1%的成功",我们要得就是那1%,就足够了.别人看到的也就是我们发出来的那1%的结果.可那99恐怕只有我们自己知道了
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发表于 2012-1-14 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也要講講我第一次做實驗的經驗.....
我記得第一次[ 離骨髓的時候.原本的步驟都寫好了(參考文獻上的方法)..
結果當天要真正做實驗的時候才發現.原來文獻上根本有很多都沒寫....
不然就是寫的很簡單.例如文獻在寫分離骨髓的時候可以離心管上看到一層薄薄的細胞層(有站友說0.1mm)好薄的一層阿.實際上根本就看不出來.然後當天就用針筒抽取文獻在所說的約略位子.然後進行培養.結果過了三天.用顯微鏡尋找我要的細胞.看了好久竟然找不到.心中實在是非常的難過.就把分離的FLASK丟了.後來經過了幾次實驗才知道原來幹細胞的數目是相當少的.所以最少要個十天八天後才看的到.第一次真的印像很深刻.所以建議分離骨髓幹細胞.不要當天或前幾天就開始找.可以多養個幾天看到的細胞數目會比較多....
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大尾巴[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我从事细胞培养还不到一年，但已经从中体现了压力和乐趣

（1）做事要认真，严格要求自己。不能因为偷懒或报有侥幸心理而不守规则。
eg.刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。
（2）找一个良好的老师。在专家的指导下可以事半功倍，很快的掌握操作技巧、发现不易觉察的问题、形成严谨的态风格、获得为将来技术水平的提高奠定基础的扎实的理论知识。找几本相关的书看一看。
（3）有一颗平常心。细胞培养不是算1+1=2那样简单，微小的操作差异或试剂批次间的差异会导致细胞状态和目的蛋白表达量的明显差别，不符合预期目标。不喜不悲，尽力而为之。
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