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标题:[讨论帖]实验室成败经验

大尾巴[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。
2.养成良好的操作习惯。
（1）物品准备充分，摆方整齐，有目的。在无菌操作过程中不要将物品拿进拿出，会增大染菌可能；无菌空间相对狭小，无目的的摆放将增加物品移动次数，取一个物品时跨过另一个的可能增加，增大染菌机会（一般的风是从上向下吹的）
（2）操作幅度尽量小，移动速度适中，快则容易产生气流，慢泽延误时间，增加了暴露时间。不要对着操作区讲话或咳嗽
（3）尽力独立完成，包括准备工具，配制试剂，除菌等过程，并不是不信任别人，只是需对自己更负责。
（4）试剂单独使用。细胞较珍贵，胰酶、血清等试剂较昂贵，一旦污染只能弃去，损失很大，交叉使用危险较大。尤其初学者，只需分装出适量用于练习即可。
3.保持良好的环境。操作空间只是室内空间的一小部分，要保证经常打扫，经常灭菌。唇亡齿寒，在恶劣的大环境中，即使在百级洁净环境下也不保险，染菌迟早会发生的。
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是个养细胞的菜鸟，才开始一个月左右，做的是海马神经元的原代培养，由于本单位实验室条件较简陋，能请教的高手不多，先前都是靠看书上的方法。做好准备后开始实验，头一会取材先把大鼠泡在酒精中消毒，顺便就可以把它淹死了，然后再取脑，分海马。结果做了两次都只养出一堆碎片（痛苦）！后来请来高手指点，人家第一下就指出：“你怎么一下就把老鼠弄死啦，那会影响细胞活力的！”
后面又发现我用的胰酶（0.125％消化十五分钟）可能不对，但是又不能鉴别到底是消化过度引起细胞死亡还是消化不够，细胞没有从组织块中分离出来。重复了三次实验以后，终于下定决心买了原配好的胰酶（0.25％），再将消化时间缩短到十分钟，终于做出了像样的细胞（这其实只是前天的事情）。现在细胞长势还不错，但愿它们能好好顶下去到我做完TUNEL，千万不要污染啊！
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分享一个彗星的经验：裂解液的PH很容易变化，每次使用时一定要新调节，否则，没有彗星细胞，原因斗不知在哪里找。
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一直在养悬浮细胞，也积累了一些经验和教训。和大家分享一下：
1 无菌操作是一切技术的基础，切记此条。这方面大家说的很多，我就不重复了；
2 在细胞状态好时，乘胜追击，准备好一切所需要的细胞原料。例如：实验同时需要采用FCM检测药物干预后细胞周期的改变，需要做IHC，Werstern Blot，RT－PCR等时，可以现将细胞处理好后，根据不同的实验步骤，保存细胞标本，然后各个击破，这样可以减少实验时间。如要收集不同浓度点和时间点的标本，细胞处理后，部分用来做流式测周期（固定那步可以放置-20度数日，待标本收集全后一起检测）；部分用来细胞涂片（固定后，可以放-20度数月，本人曾放置3月没影响）；部分用来做Werstern Blot（将细胞离心呈粉末状置-80度保存，或者提取蛋白变性后保存，粉末保存时间可达2月）；部分用于提取RNA时，可现加上Trizol混匀后，置-80度保存。原料准备好后，在根据自己的时间进行合理安排，多出时间查阅文献；
3 在进行每个实验时，一定要找到该实验的详细的Protocal，一步一步踏踏实实的完成，一般都会得到比较理想的结果。
祝各位好运！
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面大家都说了很多。但是，我想说的是尽信书不如无书！当时刚养细胞时查阅了大量文献一直以为可以马上成功了，可是养起来才知道，在绝大多数情况下光根据文献或书上说的是无法成功的！文献和书上说的有一定的道理，但是自己还得多想 多根据一些基本的原理来思考，根据自己的条件来改进试验设计，每个实验室的条件是不一样的有时可能是不同的仪器做出的结果也不太一样（我觉得最明显的就是离心机，所以每次离心的速度都要自己摸），而且有的文献关键的地方本来就是错的可能少加或多加点东西或浓度差点，请大家注意啊！可以多看几个相同的文献对比一下，最好找些权威的杂志，再自己思考。我就是因为一直相信文献上说的浪费了大量的时间和金钱，后来明白了算买个教训。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一次养小鼠的3T3细胞，把师兄仅有的一管冻存细胞拿来复苏，因为是仅有的种子细胞，特别怕污染，所以在操作上特别小心。第一天镜下看，细胞形态良好，培养基很清亮，看到有一些圆圆的折光体漂在培养基中，以为是未贴壁的细胞，没有理会。第二天培养基变浑，细胞形态极差，细胞数量也没有增加，悬浮的折光体数量增加，确定是污染了。因为是仅有的一瓶，舍不得扔掉，决定死马当活马医，用抗生素处理一下。上次在培养基中加入过量的抗生素后导致细胞瓶内长出真菌，这次严格按比例配置。先用加了抗生素的D-Hank's清洗两次，再加上加了抗生素的培养基，继续培养。第二天观察仍无起色，细胞状态不好，第三天以后，细胞状态开始逐渐转好。这是一点经验，仅作参考，还是尽量注意不要污染为好。
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发表于 2012-1-14 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我培养cho细胞的感受：
两个月前我选取了cho细胞作为我实验对象，于是在朋友那里求得细胞株，兴奋的拿回来，准备大干一场，没有想到的是，细胞却越张越不象话，开始有很多细胞悬浮，又有很多的残渣，颗粒，细胞形态也千变万化，真的如万花筒一般，可怜我实验就老是拖着，实在无奈啊！这时候，我就象抓狂一样，每天唠叨着我的细胞，天天想着该用什么办法使其恢复，开始的时候，我换了培养基，DMEM和F12一比一配比，加sigma非必须氨基酸，和丙酮酸钠，开始效果也很不哦理想，不过随着时间的推移，忽然有一天细胞居然奇迹般的变的光滑，颗粒明显减少，形态均一，透亮，贴壁良好，而且生长速度变快，幸福坏了！
我的感受是，你要象对待你女朋友一样对待你的细胞，你就会得到非常好的收获！
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发表于 2012-1-14 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

养细胞实在可以说是爱恨交加，喜忧参半。。。
手头要是一两种细胞，那还好办，怎么也忙的来，要是同时整个6－7种的，真是搞死人，开始忙的焦头烂额的，因为中间要穿插做其他实验（不能仅考养这个毕业啊)，怎么感觉上午忙完了一阵，好容易从无菌室出来，下午又进去了，等放心的出来的时候，怎么感觉一下午又差不多完了，
开始总是没有头绪，后来把所有的细胞还有特性一一总结，每次处理时间记录，这样，大概那个要早出来，那个可以到什么密度多养会啦，就比较明了了，感觉也轻松多了。
消化处理的时候，因为同时要处理很多，就把比较“骄气的”要注意不要消化过头，着重把握，这样就比较省时省功。

对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。
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发表于 2012-1-14 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是肿瘤细胞的原代培养,感触最深的是培养瓶的选择,刚培养时用的是玻璃培养瓶,传代时发现细胞贴壁不好,将培养瓶用2%白明胶铺壁后细胞贴壁生长很好,但用0.25%的胰酶消化时效果又不明显,现改用塑料培养瓶上面的缺点都克服了,希望大家作原代培养时可以试一下.
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发表于 2012-1-14 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是昆虫细胞的培养，昆虫细胞和哺乳动物细胞最大的区别就是昆虫细胞是不需要消化的，直接用弯头滴管把细胞从壁上吹下来，但是吹的力量和次数是很有讲究的，我最开始的时候总是怕细胞吹不下来，所以吹得力气比较大，最后就发现很多细胞都被我吹破了，慢慢熟悉了之后，发现吹的时候还是不要用太大的力气，怕细胞吹不开的话，可以在悬液再吹几次，或者吹之前把瓶子在操作台上磕几下，这样就比较好吹了。
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