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标题:[讨论帖]实验室成败经验

whitesheep[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的一个教训:
刚开始养细胞时，从别人那里要来了细胞，一种是野生型，一种是别的实验室 作的转染的过表达某种蛋白（我要研究的）的细胞株，拿来以后野生型长得挺好，转染的据提供者介绍，最好用G418再筛选一下，于是按他说的浓度用G418筛选，第一天死了好多，我还认为：真是有必要筛选，可是时间一天天过去，细胞一点长进都没有，一直维持原状，再过几天，全死了。哭啊！要知道好不容易才从别人那要来，后来别人指点，第二次要来以后，我再也不敢筛了，我先扩大培养转了好多，也冻了好多，有了足够的种子后，我才放心的筛，即使死了，也还有种子，不用再想别人要了。
虽然是低级错误，但新手犯的大多就是低级错误啊，写出来供来者借鉴。
第二次向别人要，受够了白眼 ，说尽了好话........窘迫呀！
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笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也来分享一下我的教训吧：
1。 我有一个试验需要把细胞点在载玻片上，吹干，观察。我为了干得快一些，就把载玻片放在HOOD的层流口上。结果被管理员批评，原因是这样会干扰层流，影响无菌状态。
2。有一段时间我的培养液的PH上升得很快，配好不久后就需要调整。后来我发现是由于我加热培养液的时间太长（1小时或者更多）。后来加热30分钟，用完就放回冰箱，培养液的PH就比较稳定了。
3。个人认为只要严格注意操作时消毒，定期清洁培养箱，染菌的几率并不大。
4。只要你把细胞当成你的宠物，记住它是有生命的，多花时间和心思在它身上，它一定会给你回报的。
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2012-1-14 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚入实验室的时候，跟着我的师兄做MTT法筛药。
1、MTT的96孔板结果参差不齐，要多难看有多难看。
当时怀疑细胞状态不好，怀疑季节问题，怀疑温度不好，重新复苏多次，请中科院的人来指导，总之，偶尔也能够出来一次好的结果，但是重复性太差了，无法提供一个稳定的、令人信服的结果。后来从肿瘤研究所来了一个高人，她看了我们养的细胞，在培养基的上方飘着许多酵母！虽然培养基颜色很好，细胞也能够长，但是仔细看，酵母还在动！！所以MTT能够有好的结果吗？
2、细胞成团特别严重（老板刚从国外带回来的时候是没有成团的！），无法得到单细胞悬液！
我和师兄几乎能想到的办法都用了，接近崩溃！后来高手用了一个5ML的注射器，接上针头，对着刚消化下来的细胞来回抽吸了几下，结果得到单细胞悬液了，好计数了，细胞状态也没有受到什么影响。后来经过几次这样的方法，后来再也不用抽吸，细胞消化下来就基本是单细胞悬液了。
3、老板是个追求完美的人，对于96孔板中任何一个稍微有点偏移的数据都不放过，要求我们继续搞一搞。
MTT要成功，要让孔间差异减少，从单细胞悬液的制备、接种一定药保证每个孔的细胞数要相同；加药干预、换液时，枪尖尽量不要接触底下的细胞层。其实仔细想想，认真一点，不要图省事，会很完美的。
就说这么多了，欢迎讨论。
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发表于 2012-1-14 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也来凑个热闹，就说说自己经历的一些细胞污染的过程吧！
最开始养细胞时都是师姐带着做实验，一步一步非常严格，之后因为实验需要就先做分子生物学，而后者对无菌操作要求并不非常严格，因此无菌意识慢慢就淡化了，后来又重新进入细胞实验，所需的细胞还是找别人送的，也算十分珍贵，但是一开始不知为何总是不贴壁，第一天传代之后，第2天一看培养液呈紫红色，PH值谝碱，高倍镜下发现一些小点，觉得是污染，但是培养液很清亮，就到园子里找了很多关于黑胶虫的帖子学习，为了解决这个问题被迫放弃五一休假，天天去实验室。先是认为污染，找别人送了另外一种细胞，结果养得很好。后来怀疑是培养箱的CO2的问题，就把细胞防到别人的培养箱里，结果也长得很好。于是就请厂家来修理了一次，再后来就能成功培养细胞了，期间我还发现新配的培养基直接用很清亮，但是在－20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。
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发表于 2012-1-17 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知其他实验室的同仁们是怎么处理6孔板，24孔板及96孔板，反正我们实验室是要一些就去买，不过我发现这些重复利用效果也不错，经过泡酸后在操作台上先开紫外灯照两小时，然后再开风机再照2小时，可以省些钱呢。呵呵，是不是班门弄斧啦？
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发表于 2012-1-17 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从开始接触细胞培养到现在已经有大半年了，实验却没太大进展，去年从我一开始着手养细胞，奇了怪了，细胞就没养活过，老师也很急，让我找原因，可是我什么原因也找不到，由于细胞培养的环节太多，老师便一个步骤一个步骤帮我找原因，先是不加盖波片（怀疑我没处理好盖波片），然后让科里养过细胞的老师帮我刷瓶子，然后让那位老师操作取原代，然后是培养基、血清，把血清的含量提高后，细胞的状态明显好了，这才认为是原先的血清不好了。细胞培养真是个考验人的耐心和毅力的活，原以为实验只是体力劳动，现在才发现，什么事情都得动脑筋，细胞养的不好，真的要好好动脑筋，从各个环节着手找原因。
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发表于 2012-1-17 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是最近才近实验室,刚进实验室时心里很不是滋味,什么都不会,自己是老板的开门弟子,上面没有师兄带,老板现在在国外,根本不可能亲手指导,没有办法,只能靠自己了,硬着头皮.从配培养基开始,在丁香园上找找相关资料,一步一步来,终于可以把细胞放到培养箱里去了,结果后两天去看,全部污染了,可怜
无助!呜呼
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发表于 2012-1-17 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说起培养细胞，想起一句歌词，“为你欢喜为你忧”，进入细胞室快两个月，可谓经历磨砺，养细胞实在是一件苦其心志的事情，前一天还为细胞生长良好而高兴，转过一天又见细胞污染而沮丧。下面是个人的一些小体会：
1.如果你是细胞培养的初学者，一定先找一株实验室内便宜好养的细胞练手，从培养，换液，传代，冻存，复苏，有一定把握以后在买来你实验需要的珍贵的细胞株来培养，不然付出的代价实在昂贵。
2.不耻下问。不懂得地方一定多问，多看书，多学习。
3.要善于总结动脑筋。目前两次复苏细胞总是不活，很可能是因为自己当初冻存细胞时细胞状态不是最好却急于保存种子，结果白忙一场。

最后祝所有的同道们实验成功。
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skytree[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
涉及到养细胞的话题就应该是几多欢喜几多愁，不过大部分时间是愁，是忧，只有在有结果的那一刻才会有一点的欢愉，甚至可以消除所有的不快。
起初在师兄的帮助下养的是原代细胞，养过细胞的大概就会知道，原代很烦人，取材时小心翼翼，可干扰细胞长得飞快，换液后镜下一看，满视野的干扰细胞，当时的心情就是想把培养瓶扔了，还要扔的远远的！！后来手法好点了，镜下需要的细胞也渐渐多了，在干扰细胞中看到自己想要的细胞，心情就是很好，之后再采用其他办法，高兴的看到自己的细胞越来越多，真的是开心至极啊！！
最郁闷的事就是污染，尤其是怀疑别人不小心给污染了，感觉真的就像自己的孩子受到不公正待遇，恨不得立刻查出谁干的，找他好好理论一番！！
就是这样了，养细胞的人们应该理解。不过后来还养了非原代，感觉爽多了，呵呵，原代细胞，唉！！
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发表于 2012-1-17 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做胚胎干细胞建系的，刚开始从囊胚培养时费了很多周折，那时因为对这种细胞特性不了解，所以实验遇到了很大的阻力，现总结如下：1.胰酶浓度不要太高，0.05%/0.04%胰酶-EDTA；当然也可以用蛋白酶E。2.胰酶消化囊胚的透明带时，不要时间太长，得到裸胚后用加完全培养液洗涤2次即可。3.ICM种植到饲养层后，一定要有耐心，ICM增殖比较慢，开始几天不要总是看，抓住时机传代。4.ICM不明显的囊胚建系成功率较低，注意选择良好囊胚建系。5.用丝裂霉素C处理成纤维细胞制备饲养层时，一定要冲洗干净。6.在ICM传代时务必注意不要消化为单细胞，单细胞很难扩增，小细胞团才好增殖。7.有的试剂在一定阶段该撤掉时就一定撤掉，一面造成不必要的浪费，例如人的ES细胞在早期用LIF，中晚期就不需要；而鼠的ES细胞却需要LIF维持未分化状态。8.做实验的同时注意国内外动态，以免白浪费时间。
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