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标题:[讨论帖]实验室成败经验

一叶[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一点经验教训：（我的教训不是细胞培养，而是一些固有的思维模式）
新实验室装修，实验仪器要搬家，安装仪器的时候，连接恒温培养箱上的电子继电器，上面有三个接线柱，而只有两条导线，不知道怎么接。实验室一位曾经用过此培养箱的教授帮忙连接的，他说，就是这么接，肯定没问题！我的固有思维告诉我，他是前辈，很有经验，一定没错！然后就满怀信心地培养我的淋巴细胞，结果.............，第二天，刚到实验室，发现培养箱的温度达到了80多度！！！，我的细胞也已经“发高烧”死了，失败！干脆，自己动手，丰衣足食。按照排列组合，两个线头，三个接线柱，共有6种接法，排除上面的错误接法，还有5种，首先把原来的高温降下来，然后逐个按每种接法尝试，接上后至少等2个小时观察温箱内是否恒温，最后，用 了一天的时间，总算把它接好了！（不要说我笨，接线柱上根本没有文字提示怎么接，曾经请教了电工，也不会接，说明书也没有了）
教训：凡事要多个心眼儿，不要想当然，要学会怀疑，我当时就是认为他是很有经验的教授，想当然地以为他接的肯定没错，根本没有去怀疑，结果造成了实验的失败。我觉得有时候思维定势在实验过程中会成为绊脚石，比自己资格老、经验多的老师的实验设计不一定很合理，我们要大胆地提出疑问，提出自己的想法，年轻的思维往往出现闪光的火花哦！
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发表于 2012-1-17 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哈哈，我也说一个我碰到的问题。
刚开始养细胞的时候，用的都是研究室其他老师配好的试剂，也没有认真去ATCC看一下自己养的细胞的照片，我开始养的细胞研究室其他老师告诉我是HT-29，但我看以往的记录写的是CCL-229，开始也没有在意，后来偶然的看了ATCC上HT-29的照片，与自己养的梭形的细胞形态差异非常明显，当时就吓慌了，半年多的实验都白作了。不过当时仍然没有死心，于是又查了一下看看有没有CCL229这种细胞，嘿！真不错，原来它的俗名叫LOVO，同HT-29细胞一样，也是结肠癌细胞，这下实验还有的补救。
等到后来弄到了真正的HT-29细胞，开始消化的时候又出现了问题，总是消化不好，要消化很长很长的时间，于是开始逐个原因的排查，最大的怀疑对象落在了消化液的身上，不过这些消化液都是研究室其他老师用了好多年的配方，是用蒸馏水加的胰酶，有经验的战友一定看出来了，不应该用蒸馏水。不过当时我根本没有经验，以为胰酶当中已经添加了缓冲液的成分，为此还与别人好一番讨论，最后将正确的做法提出来还是需要很大的勇气的，当自己用PBS配的EDTA-胰酶混合消化液在消化细胞时真的有效时，当时激动坏了，因为我改正了“权威”（研究室的老实验员）的错误。
所以奉劝各位新手，在养细胞时一定要先到ATCC的网站上先去看看自己细胞的推荐培养条件，另外千万不要迷信权威，一定要自己多看资料，勤快点，千万不能怕麻烦，光听别人的三言两语就决定自己的下一步实验，事必躬亲是会获得回报的。
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发表于 2012-1-17 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近养细胞的一点教训:
我养的是一种肺癌高转移细胞,复苏后第一天长势喜人,24小时了,该换液了,用吸管把培养液吸出,又加入了等量的新培养液,结果,第二天观察,液面上漂着很多细胞团,第三天,全阵亡了.
总结原因: 因为是肺癌高转移细胞,其特点是贴壁不牢,换液时我是直接把新培养液加到培养瓶中有细胞的一面的,结果把细胞冲了下来,连成片,最终不能贴壁,导致死亡了.
改进方法:因为贴壁不牢,换液时先把培养瓶倒转过来,把培养液加到没有细胞的一面,再轻轻倒转过来,避免把细胞冲下来.
结果: 目前细胞生长良好.
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发表于 2012-1-17 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做上皮细胞原代培养的,说来惭愧啊,养了快一年了才养出来.我觉得细胞培养关键是细节.我做上皮细胞原代培养时,失败了很多次,关键是细胞不贴壁,想了很多办法,包括使用对细胞损伤很小的accutase酶,使用乳兔,消化分离后可看到较多的单细胞悬液,但细胞就是不贴壁,预铺胶原也试过.有幸在丁香园里找到了几位培养上皮的高手,经指点原来是我使用accutase酶分离消化后就直接采用无血清培养基重悬了,没有用血清中和,损伤了细胞.其实我做平滑肌细胞原代培养时也没中和,但养出来了.但上皮细胞就是不行,犯了经验主义的错误.因此,做细胞培养时应该严格要求自己,不要偷懒,洗瓶子就是很好的例子,如果你洗的不干净,最终是细胞长不好,做无用功啊!另外我觉得丁香园确实是个很好的地方,在这里大家相互学习,相互帮助,让人受益非浅啊!
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发表于 2012-1-17 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我曾经培养过的细胞有几种是肿瘤细胞、COS-7细胞、一种p53基因敲除的细胞。我们实验室细胞培养用液的配制、细胞的冻存和复苏都由管细胞房的那个老师负责，细胞培养的用具是雇人洗的。

最初学养细胞的时候养了两种肿瘤细胞，细胞形态看上去都还不错，只是不明白为什么瓶壁上老有一些小小的黑点，问那老师，得到的回答是：“支原体，细胞养了一段时间都会有的，没关系，只要多留点细胞让细胞的数量压过它就行了。”当时以为她到底是专业人士经验丰富，恍然大悟似地哦了一声然后高高兴兴做别的事去了。

那个学期这些细胞似乎也很照顾我这新手，长得挺快。后来一个学期，我的操作已经熟练了，可那个学期养的三种细胞却轮番死光光，而且总是在我急用的时候。那老师把问题归结到洗用具的刚换成了个新手、那个学期刚学养细胞的人多且好几个都习惯不好之类的问题上面。最终发现原来是她配的溶液有问题，别人去反映新配的溶液是污染的，她说“肯定是你用的时候给污染的”，正好当时我的培基用完了新领一瓶，还没开过，没放冰箱第二天就浑了，告诉她了，她没说什么，然后重新过滤了培基，说要新买一个小些、好用些的滤器才不容易污染。后来也还出现过几次培基或消化液污染的情况，后来在我急用细胞的阶段，凡是新领了D-Hanks、消化液我都会取一些和培基在干净Ep管里混合、另取一个Ep管装少量培基，一起放在培养箱里一晚上，没变浑才敢用。

再后来的一个学期，要用的几种细胞中有的过了两个星期也长不起来，长起来的细胞周围也有很多沙子样的小黑点，全实验室所有养了细胞的都说自己的细胞长得差，那位老师很不在乎地说实验室所有的细胞都有支原体污染，她以前所在的那个单位都是用BM清除的——很贵，接着就只是一次又一次地复苏细胞，也没人去想更多的办法。我急了，查了不少支原体方面的文献和帖子，终于帮自己也帮别的同学解决了这个问题。

关于检验支原体污染，有PCR法、培养法、DNA荧光染色法。我选择的是DNA荧光染色法，将冰醋酸和甲醇按1:3混合，固定细胞两次，每次10分钟，然后用1μg/ml的Hoechst33258染色20分钟，紫外激发，细胞之间的蓝色丝网表明有严重的支原体污染。

关于清除支原体污染，有些文章比较麻烦，要注射到小鼠体内来杀灭支原体，至少这在我们实验室是不可能使用的方法；有些文章是联合使用两种抗生素来清除支原体，简单方便，用的抗生素也很便宜，我就试了这种。花1.5元买了环丙沙星（ciprofloxacin）药片，稀释成50μg/ml，离心去除淀粉之类的不溶性辅料，加入培基中，稀释成10μg/ml，跟正常培基一样用法，处理两个星期后再用Hoechst33258染色验证，对于污染严重的再用1μg/ml四环素处理。效果很不错。

我向同学推荐了这个方法，有人说自己的培基前段时间已经加了青霉素应该也能奏效，但却没有一点效果。关于这个问题的解释是：青霉素的抗菌机理在于干扰细菌细胞壁的合成，而支原体没有细胞壁，这类干扰细胞壁合成的抗生素当然对其没有效果。

别人的意见和看法有时是正确的，有时是不正确的，要做好什么事还是需要自己多查多想。
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发表于 2012-1-17 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
进入实验已经快到一年了，回首这一年时间里，细胞培养这项技术从最初的陌生可畏到现在熟练掌握确实是经历一段刻骨铭心的过程，现按照版主的要求结合自己的失败与成功经验，共同与细胞版广大战友分享与交流：

1，首先最主要的是一定要养成良好的无菌观念。我想这点是大家最初接触细胞培养时听到的最多的一句话，而且也是最受益的一句话。所以我最初开始培养细胞的时候，头脑中时刻注意这点。可能本人是学临床出身，经历过严格的外科手术无菌操作训练，所以把这种训练用在细胞培养上是游刃有余。进入无菌间一定要穿好无菌衣，换好鞋，带好口罩帽子，手要用酒精消毒。实验用具应该事先用紫外消毒半小时，所用的玻璃仪器（如试管，瓶口）用前都要用酒精灯消毒几次。总之，只要你真正做到无菌要求，那么我想细胞污染的可能性会降为最低。当然除了一些客观无法意料到因素在外。

2，其次培养细胞一定要勤快，不能有懒惰的思想。由于细胞也是一种很娇嫩的东东，所以你应该像对待孩子一样地对待它。要每天都定时到细胞间观察细胞的形态、细胞生长状态以及培养基颜色如何，真正做到心中有数。该换液的时候一定要及时换液，不要贪懒。记得去年有一次自己因为贪图轻松，没有及时给细胞换液，结果再次观察细胞的时候发现整个培养瓶里的细胞全都漂浮起来，已经都over了，害得我重新复苏了一管。打那以后，我对细胞再也不敢马虎大意了，因为我知道，一次不小心都会给自己造成很大麻烦。

希望这些经验能够给战友们一些帮助

最后祝愿大家实验顺利
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发表于 2012-1-17 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在贴壁细胞的培养中，对于细胞消化程度的把握是很重要的。不同的细胞株贴壁能力不同。即使相同的细胞株生长状态良好时和不佳时贴壁程度也是不同的。所以不要呆板的按固定的时间进行消化。
消化不足时，即使细胞能脱壁，细胞间连接物质仍未被完全去除，依然相互连接，无法在培养液均匀分散开，形成细胞团，最终影响下一代细胞的质量；消化过度时，细胞可以完全被消化下来，但细胞仍会凝结成团，不利于分散，且细胞会受到损伤。
在加入胰酶后，要将培养瓶放在显微镜下随时进行观察。当细胞间出现间隙时，将胰酶倒掉，以防止大量酶造成消化过度，残余酶液即可使细胞消化完全。当瓶壁细胞开始呈流沙状下滑时，迅速加入含血清的培养基来终止胰酶的作用。消化即顺利完成
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发表于 2012-1-17 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在刚开始养细胞时,犯的低级错误，但我们实验室刚建,我的师兄都不养细胞,可能是这东西不好伺候吧,我是我们实验室养细胞的祖师爷了,呵呵.
我从上海拿回来一瓶我需要的贴壁细胞,找老板要的.高高兴兴的拿回来后,立即打开紫外灯消毒操净台,用我精心配制的培养液,而且还用PBS洗了3遍,加入我配制好的新鲜的培养液2毫升,严格遵守无菌操作,看的比我生命还重要,因为我毕业就靠他,小心翼翼的放到CO2培养箱中,过夜,第二天早上来看发现很多细胞漂浮起来,觉得不对劲,当时心如刀绞,不是男人的坚强,就落泪.最终这些细胞没逃过厄运.
现在得出的教训:细胞在外地拿回来后,不要急于给他换液,继续培养12小时,先把原培养液倒出来一部分留着,严格无菌操作,逐渐换成自己的培养液,尽量不要一时间改变细胞培养环境太大,望对细胞培养的新手们有一点启示.
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 小中大

细胞培养是个精细的活，过程中也有许多感受，没有太多时间整理，暂时想到几条写几条：
1。无菌操作：
重要性不言自明。但是我从进细胞间操作的第一天就没有穿 无菌衣（就是普通的白大衣），没有带过口罩和手套（当然有几次处理特别重要的细胞以及在超净台外面行无菌操作时带了），因为我的师兄师姐都没有带，而且基本上很少见到污染，我现在也是这么做的。所以我觉得常规紫外照台子，酒精擦手，操作过程中只要注意，达到无菌并不是很难的事，不一定象书上写的那么正式。
2。培养液：一定要用自己的，用之前一定要摇晃并仔细观察有无污染迹象。我有一次帮别人传细胞，做完之后收拾台子拿PBS的时候发现有白色浑浊，当时脑袋都大了，以为肯定是污染（后来证实虚惊一场，可能浑浊是盐结晶），此后度过了忐忑的24小时。
3。过火：有的时候看有些人过火时间很长，胶塞都烧出味来了，其实没有必要。还有管子烧太狠应该多凉一会，我曾经用手摸过过完火的管子尖，很烫的，太热有时候也容易烫死细胞。
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气泡[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4。配液： 以前配液及分大量的液体都是10ml那么一管一管的移，费时费力，最近发现还是直接倒好，瓶口烧好的话不会污染，快而且容易保持培养基的PH值。
5。试管和培养瓶： 试管和培养瓶并不都是好的，有几次我把细胞打到试管和培养瓶了，过了一会一看，里面空空的，原来都漏掉了，因此我现在拿试管都习惯性的用小指头勾一下管底，有破的一下子就感觉到。另外管口也要注意，有裂缝的千万不能用。还有一次00塞不合适离心的时候陷到管子里怎么也那不出来，后来把细胞仍了。
6。操作中的安全 ：a。我犯的一个巨经典的错误至今难忘，刚做时酒精擦手，擦镊子，湿淋淋的就拿镊子过火，结果。。。。火顺着镊子着到手上，虽然不怎么热，可是我手上的汗毛啊，555，都被烧了。这个错误以后再也没犯。b。过完火的试管口一定不能摸，时刻记着只拿试管的下1/2。c。给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管，否则终身难忘。d。当酒精灯出现什么意外时一定要镇静，先让他着一会可能没事，不要慌乱中打坏别的东东。e。离心机尤其高转速时，配平当然要牢记，可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东（有一次我离东西，着急，放进去刚离一会我就觉得声音不对，打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子）。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心，结果吓个半死，原来别人正在离心，幸好管子没飞出来
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