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标题:[讨论帖]实验室成败经验

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7。关于污染: 污染是细胞培养过程中最不愿意看到的,原则上细胞一旦污染应立刻扔掉,但是作为新手,对待污染的判别一定要慎重。我刚做EPC时,细胞需要贴壁四天才半量换液。但是当时总沉不住气,两天就去看了一下,结果里面密密麻麻都是悬浮的大个圆形的东东(实际上是血细胞),我一看,这不是细菌吧,赶快翻司徒先生的细胞培养一书,上面说还会有浑浊,我到细胞间一晃皿,可不是么,是有烟雾一样的东东(实际是悬浮细胞太多),当时痛心棘手,觉得肯定是自己操作不合格,书上说得马上仍啊,周围恰好没有可以请教的人,一狠心,给仍了,后来发现别人养的也是那样,才知道不是污染。还有就是上面讲的PBS,其他人都说肯定污染,PBS都那样了,肯定不能要了,但我当时没扔(主要还是不舍的),结果第二天没事。所以,大家发现了污染,不一定是,要多问问别人,细胞也不急于马上仍,对于不太明显的可以再观察,对于理论上肯定要污染的心里还可存意思侥幸。总之,污染了不可系,没污染确被仍了的才可惜。
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气泡[使用道具]
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8。细胞冻存: 当细胞状态好,或者代数比较早,一定要大量冻存,不要吝惜暂时的大批使用血清,当细胞状态不好,长不起来的时候,马上取出来复苏,省时省力,不要去尝试努力恢复状态不好的细胞,费时间也费血清,会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方,-80度,液氮(甚至不同的液氮罐)都放一点,谁也不敢保证不出意外,冰箱也可能有化的时候(我们-20度冰箱就化过),都放在一块容易全军覆没。
今天就写道这儿吧,想起来再来。
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前面的群友已经总结得很好了!我就说说自己刚开始实验时的情况吧!
我养的是大鼠骨髓间充质干细胞!
1、配液:我配的是L-DMEM培养基;我当时忘记加碳酸氢钠和Hepes,所以过滤前的时候调好PH值7.2,用了不久培养基颜色就变深了。分析原因:缺少了酸碱缓冲体系,培养基容易在空气中容易变碱!另外,过滤后的培养基PH值会升高,比原来越高0.1-0.2。而且,血清也偏酸,所以自己要心中有数。记住,细胞耐酸不耐碱。
2、这个错误相信大家觉得很好笑,我每次用培养基时,都是从4度冰箱拿出来后直接用于细胞培养,结果每次都是培养基没有污染,但细胞总是没能存活。
3、污染;当你发现细胞污染时,首先要冷静,如果你的细胞有冻存或者比较容易获得,那么可以查明原因后扔弃细胞;但是,如果你养的细胞比较珍贵,或者你还想继续养的话,我有个办法:用10倍的抗生素冲洗细胞,洗两次后用2倍抗生素培养细胞。(如果是悬浮细胞的话则离心冲洗)。这方法是师兄教我的,相当有效。
剩下的都让其他群友说了,等我想起什么再来!
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lixi559[使用道具]
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54
 
呵呵

失败——太多次了,养过很多次小鼠的间充质干,失败过很多,恩,有一次,很认真,很仔细的做每一个步骤,结果,去悬浮后,只留下很多碎片,郁闷啊。想了很久,实在找不出原因,恩,很有可能是老鼠的问题。

看见一个战友写到安全问题了,突然想起我的那只火手……唉,一只沾满酒精的小手,一不小心变成了火手,谁说不疼的,幸亏烧掉的只是毛,不是皮

总之,我的座右铭是,对待细胞要像对待孩子一样。它们是那么的娇小,柔弱,它们需要我们的精心呵护

加油啊!
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BOSS2011[使用道具]
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我上学的时候创造了一次染菌19瓶(细胞sp20)的记录,回想起来,当时的操作真是烂,工作后在做细胞培养和蛋白纯化,一直心理有个结,经过同事们的帮助和自己的努力终于有进步了。
对于细胞培养也有自己的心得:
1、不要心存侥幸,严格按照操作要求做,记住不规范的操作可能不染菌,但早晚会染菌的
2、准备工作做好,计算好物品,有条件应该准备备用的物品,不要到时候出现东西不够用的问题
3、清洁灭菌工作十分关键,一定要保证容器具的无菌。我们有一次培养细胞发现染菌,培养基,培养瓶,移液管等等,忙了好几天才发现是真空湿热灭菌箱有问题,造成整个实验中断。
4、按照试剂的保存标准保存,象血清、胰酶等没开封的-20℃,开封后-4℃保存一般不超过7天(用完它吧,不然浪费了)
5、一定要弄清楚每个组分的作用,特点,比如NaHCO3容易分解,因此培养基在过滤除菌时pH会上升,一般是0.1-0.3,所以在过滤之前,要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点,就不会做相应的处理,那么培养基不符和要求,细胞就长不好
6、还有做实验中间经历过的问题越多,提高就越大,你会从中学到事故处理方法,以及实验设计的注意事项等,因此,把握每次出问题的机会去学习(当然,不是故意出问题),多思考分析,查资料,问专家,几年下来,你会发现自己也是专家了。
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前面的群友写得很好。我是一个新手,才培养了一个多月。当然也犯过错误,同时也收获了不少。
写得肤浅了大家不要笑哦!
1.第一次让我自己操作的时候,当时我也跟了2周了,基本的操作自己也能够详细的在脑海里过一遍,可当时换液的时候就是有些手忙脚乱的,培养瓶、移液管、盒子等要用拿的时候就是感觉别扭,结果第二天去看培养液就有点点浑浊,后天倒置显微镜下就很明显的云雾状阴影了。所以在超净工作台里操作的时候,工具的摆放要合理、顺手。
2.其实自己很早就想做细胞培养了,苦于没有实验室,更没有人能带我!但是虚心的向在做的老师请教,并不时的去做做清洁、修修电脑的,后来老师就同意带我了,而且还从基本的开始教我,顺便还可以磨磨性子,挺好了。攻关也很重要哦!
3.细胞复苏的时候,以前都是先离心,然后去上清的,后来看书上说可以直接十倍稀释培养液,减少dmso的毒性,而且加培养液的时候要缓慢的加入,以减少渗透压的急剧变化造成细胞的死亡。所以细胞的培养是一个不断的学习改进的过程,有时操作不规范仍然可以将就,还没发现自己的失误。
4.思考也很重要。记得无菌观念的养成就得不停的思考,这样会不会污染,操作也得如此,每一步都得准备好。
现在做体外实验才觉得自己像在做实验!
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duoduo[使用道具]
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我没有想到自己会养细胞
养了一个月了还没有端倪
心里确实很痛苦。
问了丁香园问老师
问了师姐问师兄。
养了一遍又一遍。
第一次是因为不明白大鼠脑微血管内皮细胞并不是要求新生鼠而把刚刚生得9只小老鼠全都处理掉了。可惜的是把不该丢的丢了。离心后把沉淀丢了。把上清夜培养了几天,细胞很少。也不是。
经过取经。
第二次我知道了步骤。但是留在筛网上的东西太多。离心后足有2ml的沉淀。分两个培养瓶培养,结果杂质太多。但是我是根据老师的指教做的。不明白为什么?就是分离不出来。
又一个人建议我买内皮细胞分离液。现在已经定了。还没有来。
我的母老鼠因为难产死了。没有原料怎么做呀。
买老鼠是辛苦的,养老鼠也不是那么简单。
洗瓶子可能是最恼火的了。泡酸,烤干。配液。过滤。
每一步都那么繁琐。
但是,里面也有快乐。
比如各位师姐师妹师兄师弟在一起抢抢烤箱。铮铮3蒸水。打扫卫生。
推水。
高压消毒。
相互讽刺一下细胞。
总之,痛苦中有快乐。快乐中也不乏痛苦。
我希望自己的细胞这次能长出来。给她照张相。
人生的每一种经历都是一种风景。
不要错过风景中的美丽
不要错过风景中的快乐
我希望在我毕业的时候能够理直气壮的对师弟师妹们说:
我养过细胞了!
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MCF-7细胞株,一个月前,我很兴奋地开始和它打交道!
在看过很多关于MCF-7的文献后,我本以为不难的,但是这种感觉是错误的!理论毕竟只是理论!
首先就是细胞株的购买问题!这是书上没有的,只能在网上找到联系商!
买来以后,面临着很多细节问题!例如,无菌操作问题,记得有一次,我用了一个不规范动作,害怕自己污染了培养液,于是想扔掉,但是又觉得可惜,幸亏师兄很肯定的告诉我没事的,因为他以前也这样过,不影响培养的。
现在进入诱导分化的过程了,数量上我有把握达到需求,但是培养液过多,怎样挑选优质细胞注射裸鼠呢?
总之,每一不都不是 书上说的那样简单。我的实验正在进行中,也期待以后得到高手的指教!
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我做过磁株分选干细胞,需要一定数量的单个核细胞,最初在洗涤细胞时总是见到很多絮状物(多是血小板和细胞聚集在一起).于是采用800-1000r/m,10m是速度低了在去掉上清时易丢失细胞,高了去血小板效果不好.感觉1000r/m,0m,好,去上清时余留200-400ul洗涤液.
用淋巴分离液分离血液,收集白膜层后,尽量让吸取的percoll稀释(一般五倍体积),转速应至少1500r/m,10m上,足使细胞沉淀.
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loli[使用道具]
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不知各位在细胞培养中,用培养板时,在换液过程中是否遇到过这样的问题,细胞出现成片死亡的现象,刚开始时,是因为在给干预时出现的上述的现象,所以还以为是药物作用的结果,但因所有的浓度的出现了同样的问题,那真叫郁闷,原来是在换液的时候把超净工作台的风开着没有关,被风给吹干了而引起的细胞死亡。因此,在对培养板的培养物进行换液时,应注意:1.可以把超净台的风关掉;2.吸掉原培养液后立即加入新鲜培养,动作要迅速。
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