[讨论帖]实验室成败经验 - 经验共享

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标题:[讨论帖]实验室成败经验

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚养细胞1个月
一个月前在我师姐带习下，养了293细胞，学了不少细胞培养的技术（非常感谢我师姐）
经验不多
谈点教训吧
细胞消化：开始时养293细胞，师姐教我直接吸管轻吹细胞分瓶，效果还不错，很容易就吹下来了，省去酶消化步骤，省掉一步污染的环节
当我养MDCK时，就想直接吹就好了，^_^吹了半天，吹不动，MDCK贴得可真牢！只好向师兄要了点0.125％胰酶，开始消化（当中不时拿到显微镜下观察），
大约过了2分钟，发现细胞逐渐变圆，细胞间隙增大，我担心消化过度，马上加培养基中止消化，并用吸管吹！
无奈的是我用吸管吹了半天，死活还是吹不下来，太郁闷了
只好吸走培养基，重新加胰酶消化，大约再消化了1.5分钟（这回置于37度培养箱中）,并镜下观察，细胞间隙这回更明显了，细胞也很亮，加培养基中止消化，并用吸管轻吹，细胞这回终于很容易吹了下来

过了几天，又该分瓶了，有了上次教训，这回我直接就用0.125％胰酶（自己配的）37度消化3分钟（期间未观察），加培养基中止消化，这回吸管一吹，不得了，一吹就整片掉下来，很明显消化过度！
接着我就不断吹培养基希望将细胞吹开，一吹不得了，起了好多泡泡（后来看书知道这种吹法对细胞损伤很大），分瓶后培养观察有很多细胞碎片

总结教训：细胞消化跟多因素有关，如细胞状态、培养瓶、胰酶活性等有关，如胰酶时间久了活力下降，细胞代数增加、细胞密度都影响贴附强度
消化时一定要不时观察（或许有经验的高手们不需要），这样才能得到比较好的效果

TNT[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了这么多兄弟姐妹的经验之谈，真长了不少见识．

在这里我也谈一个小事故吧，以供参考．

刚进细胞室的时候有些小的规则不知道，在收拾做实验用的东西后，我发现无菌操作台的玻璃有些脏，于是就自作主张用７５％的酒精去擦，结果傻眼了，那一点点花变成了一大片．操作台整个不能用了，因为几乎看不到里面了，只能换玻璃了．

后来师兄想了一个好方法，用牙膏擦拭，效果非常好，如果有哪位新手也遇到这个问题不妨一试．

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前两天看到有人换无血清培养基的细胞出了很多问题，谈谈操作方法和注意事项，希望能帮助他们找到实验中的不足，尽快完成好实验．
有两种方法使细胞适应无血清培养基（SFM）:
1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
　　以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
　　当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
　　以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
　　当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
　　每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

　　另外，需要注意的是血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
　　处于对数生长中期
　　大于90% 活细胞率
　　适应时以较高的起始细胞接种

rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，我先抛砖引玉吧，其实实验中感触也是很多的。
记得刚养心肌细胞时候，开始时候很顺利，但有一次突然细胞就不怎么贴壁了，换液时候一吹打，就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱，可是别人的细胞都长的很好啊，培养基的问题？我仔细观察了一下，培养基粉红透亮，绝对不会污染，血清也没有问题啊，大家都是公用的血清，当时我很迷惑，后来我象老师如实反映问题，他听完我的叙述后想了想，让我把培养基拿给他看，然后告诉我，你的培养基颜色太深了，肯定偏碱，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，
～～～～这个可以灭菌？？？，就算是过滤除菌也是很困难（危险）的事情吧？

培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的，这也算是实验的一点收获吧，呵呵，当然还有别的体会，以后慢慢说吧。

one[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

HCL当然能灭菌了，用胶塞封口，然后在用注射器插在上面，保持内部压力能部分释放，上面传下来的方法，也不知道是否有更好的方法，反正我们是这么做的，难道你培养时候酸和碱不灭菌么？那如何应用呢？如何调节PH值啊？谢谢讨论，呵呵

穿越时空[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

养了近一年的细胞，说不上有什么经验，谈一点我的体会吧。一开始接触细胞培养的时候很多人都会非常小心，一般很少污染，各种动作都小心翼翼，深怕污染了细胞，如果样的细胞少还好一点，如果养的细胞多，我养了3种，时间长了就会觉得很麻烦，尤其那些长得比较快的细胞3天传一次代，周末节假日还要看看，后来有一段时间老是污染，分析原因排除培养的因素，因该是实验操作失误引起的，所以说，越是熟练越不应该大意。
有些细胞消化后成一团一团的，我做的NIH3T3细胞就是这样，有时生长也不好，后来和有经验的老师、同学以及园中的战友交流，在0.25%.胰酶的基础上加了0.01%的EDTA,果然好消化。对于生长不是很好的细胞可以多加点血清，再不行加点谷氨酰胺。
在做血管内皮细胞的原代培养，已开始也没有指导，更没有什么经验，丛书上找来protocol，从医院要来脐带，等到第二天再做，养了好久也没有养活，后来通过向别人请教，才知道拿到脐带后又马上就接着做，而且对于培养基要求很高，经过发反复复的失败和摸索，终于养活了几次。
细胞培养这么久以来，最大的感受就是养细胞一定要有耐心，不怕麻烦，我们实验室学生实验的瓶子都是自己刷，细胞配用用具很多都需要泡酸，如果没有一定的耐心，恐怕很难进行下去。尤其是长时间的培养细胞。
另外失败的时候，不要马上就重做，更应该好好分析失败的原因，从中学到知识。不清楚的地方要及时向别人请教，学习别人好的经验和方法。

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发表于 2012-1-17 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我以前是做临床的,做实验从来没有接触过,养细胞时,别人说你是做外科的,无菌操作很熟,养细胞应该没问题,自己也这么想.结果第一次养细胞第二天细胞全部污染了,非常苦恼,自己千小心万小心,怎么还污染?后来发现因为实验操作时步骤一般较多,光凭脑子记不行.有时稍一分心就会在一些小的细节上出错,从而导致前功尽弃.以后,干脆把步骤写下来规范化,到哪一步该加什么就加什么,再没出过错!

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

到实验室已经三个月了，培养新生鼠心肌细胞，经历艰辛，有欢乐有。。。希望与大家一起分享
　　　1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。后来解剖开后才想起来，本科时候解剖老师说新生儿脏器位置偏低，，，，后来就在大约第5－6肋骨处插入剪刀尖，横向剪开胸骨，大概开口8ｍｍ就可以挤出心脏了。每取一个心脏大约1ｍｉｎ。
　　　２，培养基的使用，虽然大多数人用的是DMEM高糖培养基，可是又有人用的是1640，同样也有效果（心肌细胞波动良好），同时实验室里也有师兄正使用1640，我就偷懒，就用1640，可是细胞就是不搏动，后来查了资料才知道，1640的钙离子浓度太低，而DMEM钙离子浓度1.8×1000（－3）。这是比较适合的浓度。后来我就自己买了DMEM培养基就可以了，细胞博动的很好看。
　　　３，消化心肌组织是出现絮状物质，没有办法去除，吸出已经消化的细胞时由于絮状物质的干扰不能吸出。我试着加大离心速率，期待能去除，可是2000rpm*10min离心后，居然它还是悬浮着。那次消化心肌非常失败，后来有一次在医院食堂吃饭，同桌的一位脑外博士，提到他消化脑组织，消化过渡的时候也会出现，这样的现象，后来经人指点说的细胞破了，DNA出来了。哦，我才恍然大悟，原来如此。以前一味得追求心肌细胞消化的彻底，就把心肌组织剪成肉沫状，……。以后消化的时候就是不能太小了。
　　　４，在园子里提到两种消化方法，一种是用恒温振荡器，一种用磁棒搅拌，原来以为胰酶的合适温度是37度，我用前者，可是消化结果，细胞数量很少，经过8次每次消化8分钟后，剩余的组织块还是很大。没有办法了，用后者，在室温20度的情况下消化结果好多了。
　　　５，当我把组织都消化了，什么都没有剩余了，我就把那些液体去离心1000rpm*10min（园子里一般推荐用的），可是我发觉：离心下来的细胞非常少，冥思苦想。后来有人提示说，离心标准单位是用g，大约是350g，我就按半径换算了，结果发现350ｇ应该是1500ｒｐｍ。于是下一次消化时改用了1500ｒｐｍ，细胞就多了。不死心，把上清去除继续4000ｒｐｍ离心，发觉还是有细胞剩余，不过这些细胞台盼蓝染色存活率比较低约40％
　　　以上这些与大家共同讨论，谢谢。我也是个新手，希望大家能互相帮助。。。。。。。加油

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先谈谈细胞培养中的一些小体会，希望对他人能有所帮助。
⑴理解每一个步骤的作用、目的，也就自然会明白该如何去做，不要照葫芦画瓢的做，初学者切记！问前辈问题之前自己一定要先想一想，采纳建议前也要先想想对不对，靠别人有时不如靠自己。
⑵细胞室要经常开紫外灯消毒，注意选择好消毒时间，很多人习惯开一晚上灯，第二天一早关灯，这样不好，臭氧味一时散不去，对进屋做实验的同志健康损害极大！所以开紫外灯之前最好和使用细胞室的所有人都商量一下，找个没人做实验的空当消毒，大家一定要互相关心爱护！
⑶有些细胞可以只用EDTA消化，比用胰酶经济，且配制步骤简单；消化程度至细胞之间分离，然后用吸管轻轻吹打，避免过力。一次消化的细胞瓶数不要过多，因为倒掉EDTA后细胞会逐渐再次贴壁，后吹打的瓶就不容易吹下来了；如果出现这种情况，再次加入EDTA消化而不要用力吹打。
⑷即使所用培养基品种一样，养不同的细胞也要使用不同瓶的培养液，我以前没有在意这一点，后来总是觉得个别细胞长的像另外一种细胞，扔了可惜，留着嘀咕，实在烦恼。
⑸细胞瓶数多起来以后仍旧要像稀有时一样的照料它们，马虎不得。一分耕耘一分收获，时时刻刻都要细心。
此外，还想和大家探讨一些“新奇”的东西
我进细胞室是从来不穿白服的。我们的新细胞室也没有递物窗，也没横拉的门，每次实验时用塑料小筐把需要用的培养液等物品直接带进去。这些做法和书本上写的传统的细胞室设置布局要求完全相悖吧？可是我们很少污染，仅有的几次污染据分析也和以上无关，而是由个人实验操作或者马虎大意造成的。关于白服，如果穿细胞室专用的那种后面开口的太不合身太肥大了，尤其是袖子，肥，在超净台里移来动去带动的气流大，一不小心还有可能碰到瓶口，后来就干脆不穿了，进细胞室只是把平时穿的白服脱了，自己的衣服肥瘦合适很方便，不会带起大气流，夏天更好了是半袖的。并且，夏天里如果再套件大白服也太热了，再戴上帽子口罩就更不人性化了！（口罩我也是不戴的，不说话就行了，非出声不可时也不能对着工作台喊。戴的口罩薄了松了没有作用，厚了紧了大脑乏氧，不是么？）
我说的可能会引起一些同志的不屑，不过这些都是事实，并且都是经过实践检验了的，希望能引起大家的一点点注意和思考。对于我来说，至少我明白了，被大多数人认同的、被大多数人每天使用的方法并不一定是唯一的最适合的方法！
罗嗦了很多：）最后还是用我开始时的那句话结尾吧，理解每一个步骤的作用、目的，也就自然会明白该如何去做，不要照葫芦画瓢的做。我想这并不仅仅适用于细胞培养。

831226[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是做流式分选后再处理细胞，看周期和凋亡的。
一次分选完后，将细胞集中起来，打匀后加入另外一种细胞，4，8，12，16小时收获。熬了一晚上，终于将所有时间点的细胞都收集好了，然后做流式，分析周期和凋亡。可是，一上机，发现细胞数不对，而且都是凋亡细胞。这是怎么回事？我出了一头的汗。将细胞在镜下观察，发现都是分选出的凋亡细胞。另外一种细胞没有出现！！！
消失了？？？不可能。于是，我又将另外那种细胞拿出来看看，里面的细胞一切正常。说明我没有将它取出来，但是我的确吸了3ml呀！！
再一分析，由于我处理分选后的细胞时间较长，因此，在去另外一种细胞的时候，细胞沉淀到下层去了，结果我取细胞的时候，是取的上层液体，因此最后上机的时候只有分选的细胞而没有另外的一种细胞。
花了一晚上时间，还不算前期进一周的准备时间，都付诸东流了！后悔之余，一位师兄安慰我说，实验出问题是较常见的。重要的是以后每一步都要有检查的步骤，这样才能让实验循实验计划进行下去。要反思！！
从那以后，每次实验，我都思考很多，将有可能犯错误的地方标出来，并尽可能的找可以检查实验是否正常的点，以保证实验的顺利进行！终于，我的实验前期结果如愿获得。以后还要继续做，但我对实验的结果充满信心。

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