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标题:[讨论帖]实验室成败经验

+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的7年细胞培养经历
算起来从第一次养细胞,到现在已经有7年的时间了.最初选课题的时候我就铁了心要做细胞培养,而不是微生物,因为喜欢这个技术,觉得干净,技术含量也更高,呵呵,那时候还上大四......
刚刚进实验室的时候，什么都不懂，好在我的特点就是细心，勤学好问,从洗瓶开始做，那时候觉得做实验有一半时间在准备,由于我们实验室细胞培养历史悠久,老师经验丰富也耐心,所以进步很快,大约1个月就入门了,3个多月完成毕业论文,CHO细胞的驯化,得了很高的分数.
研究生课题我选的是造血干/祖细胞体外培养,觉得比较前沿...后来发现,每次做实验都要去产房取血,早晨预约好就去医院了,然后和家属一起等在产房门口,宝宝一出生,护士就将取的脐血当着很多人交给我,看着家属奇怪的眼神,想想真是有趣..当然,每次我是祝愿宝宝健康的.但是分血是需要时间而且很辛苦,经常实验做到很晚...最初实验没有进展,烦躁时真想砸东西,但是咬咬牙挺过来了,论文答辩都总算顺利...
毕业后也养过很多细胞,还使用生物反应器大规模培养.其实细胞养好了是非常结识的,搅拌通气都活得都很好...
回想起来,养细胞就如照顾小孩子,要用心的...其实养活细胞不难,养好就不容易了.细胞中原代细胞最不容易养好,细心就好.....
除了经验以外,对于细胞的特性,代谢,培养基成分都需要相当的理论基础和水平,如果仅仅只是动手养细胞，那么只是在操作的层面上，其实养细胞只是一种手段而不是全部，所谓学无止境吧...
现在由于工作关系已经不做细胞培养,但是我得细胞培养经历总是让我十分的怀念...有经历自然有收获...有时间仍然到细胞版来看看，能够有不少收获。
希望各位仍然做细胞的朋友喜欢自己的细胞,喜欢自己的工作...
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我才开始养3周细胞，而且没有师兄／姐的指导，完全是自己看书／查网上资料，但通过已经考验，从没污染过，细胞状态从不好变好，而且已经同时养3种了，其中2种是我们实验室没养过的，冻存／复苏都很成功。我想，只要认真，养细胞真的没那么难。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在做单细胞凝胶电泳的时候，玻片清洗的时候一般都是先泡酸在冲洗，不能用洗衣粉清洗，因为洗衣粉里面会有荧光干扰，影响试验结果。泡酸后很难保证玻片上的酸完全清洗干净，残留的酸会影响试验，后来我们试验的时候在配琼脂糖时加入少量酸碱指示剂，这样玻片上残留有酸的时候琼脂糖一加上去就会变色，很容易判断出玻片是否清洗干净了。
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伊莎贝拉[使用道具]
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发表于 2012-1-17 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养原代大鼠成骨细胞，也谈谈自己的感受：
老实说一开始我是比较顺利的，因为我们实验室曾经有师姐养过，整整摸索了一年，留下不少经验。我是按她留下的实验记录采用两步消化法，结果第一次就养活了，导师表扬了我，让我沾沾自喜。没想到很快我就碰到了难题，在做细胞鉴定（alp钙钴法染色）时，着色细胞很少。我以为是试剂出了问题，于是重新配，结果还是一样；我又把一些老试剂换成新的，结果还是出不来，几次下来让我很沮丧。这时候我才意识到养细胞不是那么容易。通过查阅相关文献，咨询做相同细胞的研究生，帮我分析可能是细胞纯度不够，需要进一步纯化。于是我用反复贴壁法，酶消化法，去除大量成纤维细胞，再次鉴定，结果如我所想，大片细胞深染。
通过这件事让我颇有感触，得出经验：光靠前人的经验不够，做实验要自己钻研！
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baidukk[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养了半年多细胞了，CHO。
养细胞必须有耐心，必须细心呵护。
养了好多天，忽然状态不好了，或者是一起全死了，那种感觉太郁闷了。
细心一点。举个例子，有一次冻存细胞。准备了半天，冻存液都是现配的，高压都准备了好几次，总之那时刚开始接触细胞，麻烦的很了。我养的是两种细胞，一种转染了，一种没转染。最后发现了个致命问题，离心前忘了标号了。那个感觉啊，想哭又哭不出来。白忙活了一个晚上。亏了师兄安慰我，算交学费了。
再就是，那次细胞状态最好的时候懒，好多东西也都没准备好，没涂片做组化。等到都准备好了，细胞状态又不是很好了。还是郁闷。
所以，时常告戒自己，耐心点，细心点，勤奋点。
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发表于 2012-1-17 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶也谈谈自己的一点体会：（偶养的肾小管上皮细胞）

其一：我认为尽信书不如无书，书上所写不可全信，因为每个实验室条件 都不同，而且细胞类型不同，所采用的方法和诀窍也不同，有些书都是为写书而写书，就象目前的医学论文，你照着别人的剂量和方法，几乎没几篇可以重复，所以不可照搬书本
其二：细胞株一定要好，我们开始用的细胞株不行，老死，后来换了北京的细胞株，就很顺手了
其三：要自己摸索，不要人云亦云，例如我师姐说消化时间不要过久，约一分钟，但我的胰酶和细胞不同却要2分钟；还有一个著名的回国教授指导我们说，不要吹打，否则细胞会吹死，因为他在国外从不吹。我发现不吹根本不散，所以我坚持吹
呵呵，现在我的细胞疯长，不过可是艰苦摸了两个月哦
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发表于 2012-1-17 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养骨髓间充质干细胞的体会:
我养的细胞是贴壁细胞，在不断的摸索中我总结出以下几点：１.培养瓶泡酸必须彻底，冲洗时，流水冲洗要多于２０遍（我一般冲洗２５遍）蒸馏水冲洗２遍，三蒸水冲洗２遍，避免因冲洗不彻底而造成细胞的死亡。２.培养基发现有浑浊一定要用针头滤器再抽滤一下，然后再加入胎牛血清。３.血清最好１０ｍｌ分装到小瓶中，每次用时溶解一小瓶，这样可以避免培养基污染后再抽滤造成营养流失。４.最初开始培养细胞时，有一次发现细胞中出现一些空泡，但细胞的状态很好，问别的老师，他们也没见过。于是就当细胞营养不良，每天换液，过了三天这种现象就消失了，后来翻阅了资料才发现是细胞自然向脂肪细胞分化了。换液调整为两天换一次（以前三天换液一次），以后再也没出现过这种现象。
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发表于 2012-1-17 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道是不是因为天气越来越热了，细胞变的越来越娇了．好不容易这才顺顺利利的长了起来．正好也借这个机会做个小总结吧，希望能提起大家的注意．

１．培养液一次最好不要配太多，以一升为宜．用完再配．这样可以保证培养液是新鲜的，不会出现这样那样的问题．

　我以前是一次配很多，３至４升，结果一下子用不了，都堆在冰箱占地方不说，而且到了用的时候出现了各种问题，pH值也变了，双抗也感觉不强了，还得加这些来平衡，无形中增加了染菌的机会．

２．最好什么都用自己的，这可能是老生长谈了，有时候总觉得用不多就借一下别人的，但我也相信很多人吃过这种便利的亏吧．所以就是再小用量的试剂也要自己过滤一小瓶，用着放心．

３．如果是过滤前调的ＰＨ值，最好过滤后再测一下，我近两次发现1640培养液在过滤前后ＰＨ值差别很大，升高了将近０．５个值．如果有这种情况发生，可以用无菌ＨＥＰＥＳ缓冲一下，５００ＭＬ加１ＭＬ即可，再用精密试纸测一下．

４．培养瓶的灭菌方式：干热和温热分别宜合不同种类的细胞，提前查清楚能事半公倍．如果多次复苏不能活，请考虑一下是不是灭菌的方式不对头．如果是高温干热灭菌的话最好是包两层牛皮纸，而不要用玻璃纸，因为高温容易把玻璃纸烧碎，用时容易掉入培养瓶．

　　以前跟着师兄师姐做，养他们分出来的细胞总觉得很简单，到了自己做的时候才发现原来细胞培养是这么一件细心的事，稍不小心细菌就会入侵你的细胞．呵呵，可能这也是大家都经历过的吧．
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发表于 2012-1-17 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前一段时间我们养的A549一直状态很不好，细胞中又很多黑色颗粒，细胞有点肿胀。后来发现是因为用DMEM高糖+10％血清培养液并不适合A549的生长。我们换成了1640+10％血清，A549的状态非常好。协和细胞库的老师说A549在F12中生长也没问题。看来培养液还要真对细胞的种类进行选择，对细胞的生长影响很大呢！
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吴才子[使用道具]
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发表于 2012-1-17 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的实验终于告一段落了，回想起一年的实验历程，怎一个难字了得！除了开始做实验时，细胞长得比较好之外，这一年中我始终在和我亲爱的细胞作斗争！曾经有一个月我养的原代细胞都不贴壁，在找遍了各种原因之后，我已经彻底绝望了，就在这时我的细胞有莫名的贴壁了，到现在我也不知道是什麽原因，好像是细胞在考验我的耐心。把我的经验告诉大家，希望大家可以少走点弯路：
1，养细胞是个细致活，事无巨细最好亲自动手，任何一个环节都马虎不得，急不得烦不得，细胞也是有感情的，你对它好，它才会好好长哟
2，无菌观念非常重要，尤其是养原代细胞，污染是一个大难关，随时都要有无菌观念，当然这一点是要慢慢培养的。
3，传代时如何使细胞种的均匀，这是很多新手容易碰到的问题，除了要吹打均匀之外，建议最好把用培养基吹打好的细胞从培养瓶中转到一青霉素小瓶中，用枪种到培养瓶中，这样就可避免分布不均的问题。
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