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标题:[分享帖]流式图片专区

笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在完全理解了。而且我今天做了一次，但是正象你说的，效果很差，FITC几乎没有信号，奇怪的是显微镜底下也没有显色，我怀疑是哪个步骤出了问题，我会再对照说明分析一下。不管怎么样，还需重复一次。
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还有如下问题
1.步骤3和7离心后是否都应该弃上清,而留下层细胞成分,再用PBS重悬细胞
2.上机时血小板浓度调到多少适宜.
3.抗凝全血用800rpm离心得到的上清为富含血小板的血浆,而用2000rpm离心得到的是无血小板的血浆,血小板被沉在下层,和细胞混在一起,这种说法对吗?
4,多大的离心转速会破坏红细胞和白细胞,如果细胞被破坏细胞碎片会干扰血小板设门吗?

请赐教！ 谢谢！
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了了[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tianmei001 于 2012-1-20 08:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我还有如下问题
1.步骤3和7离心后是否都应该弃上清,而留下层细胞成分,再用PBS重悬细胞
2.上机时血小板浓度调到多少适宜.
3.抗凝全血用800rpm离心得到的上清为富含血小板的血浆,而用2000rpm离心得到的是无血小板的 ...

1 是的
2 浓度以流式检测的细胞速度低于3000/秒合适。
3 基本正确。
4 一般3000转不会破坏。
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了了[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
听说可以用流式分选处于不同时期的细胞，哪里可以做？效果如何？
-----------------------------------------------------------------------------------------
当然可以，只要方法适当，其分离效果甚至要好于磁珠分离系统。
流式分选需大型的机器，如BD公司的FACAS vantage型号。
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问了了，对于空白对照标本平均荧光强度应该怎样设定？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
       再次向您请教!
       我想一次上机操作多收集些病人血样,所以想存放一下标本.您看应该采取下列哪个方案:
        1. 全血--固定--4℃存放多长时间--加抗体
        2.全血--固定--加抗体--4℃存放多长时间(4℃温度是否合适?)
        或请您推荐一种方法.
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-1-20 08:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #76 tianmei001 的帖子

第二种方法标本可保留3天。第一种方法如果采用富血小板血浆检测，有关资料提及可存放5天。建议你自己试几管。
了了前辈，您的意思如何？
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-1-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还真得请你帮我分析分析，因为进展不顺。我这两天同时做了两种条件下的染色，一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；另一种是把细胞用Trypsin收集下来，然后加入反应混合物,用于做流式。其步骤包括固定（4%paraformaldehyde at RT for 1hr) 和permeablization（0.2%TritonX-100 on ice for 3 min) 然后加混合物 （50ul at 37C for 1hr in dark)基本上是一样的，但是奇怪的是，在coverslip上做出来的信号非常强，而把细胞收集下来的在显微镜底下几乎没有特异性的信号，这样子的肯定也做不了流式了。不知道是为什么？
   
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了了[使用道具]
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发表于 2012-1-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于空白对照标本平均荧光强度应该怎样设定？
-------------------------------------------------------------------------
这个没有特殊要求，一般对照只要不太高就可以了。
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了了[使用道具]
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发表于 2012-1-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 moonlight45 于 2012-1-20 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我还真得请你帮我分析分析，因为进展不顺。我这两天同时做了两种条件下的染色，一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；另一种是把细胞用Trypsin收集下来，然后加入反应混合物,用于做流式 ...

我不知道你做：“一种是细胞种在coverslip上，然后加上反应混合物（lable+enzyme)，用于显微镜观察；”时有没有设对照，如果设对照，且对照没有显色，我觉得是可行的，如果没有设对照，必须考虑到是不是非特异反应。
你在多摸索一下试验条件吧。
祝成功。
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