细胞生物学

Illumina公司的测序平台在下一代测序平台中广受欢迎，但是其出售的DNA测序文库构建试剂盒却仍然价格昂贵。本方法可用于从染色质免疫共沉淀（ChIP）DNA构建高质量的测序文库。方法中使用的关键试剂均来自于第三方供应商，从而大大降低了测序文库构建的成本。本方法已由Snyder实验室不同研究者测试并优化。
Illumina公司的测序平台在下一代测序平台中广受欢迎，但是其出售的DNA测序文库构建试剂盒却仍然价格昂贵。本方法可用于从染色质免疫共沉淀（ChIP）DNA构建高质量的测序文库。方法中使用的关键试剂均来自于第三方供应商，从而大大降低了测序文库构建的成本。本方法已由Snyder实验室不同研究者测试并优化。


材料和试剂


1. QIAquick PCR纯化试剂盒(#28104)

2. QIAquick 凝胶纯化试剂盒(#28704)

3. MinElute PCR纯化试剂盒(#28004)，柱子4度保存

4. Gibco 超纯水 (#10977-015)

5. End-it DNA末端修复试剂盒, Epicenter #ER0720

6. Klenow 片段(3’ -> 5’ 外切酶活性), NEB, #M0212S

7. 100mM dATP, Invitrogen #10216-018 or VWR #PAU1201

8. LigaFast 连接试剂盒, Promega, #M8221

9. 2% E-gel, 预制琼脂糖凝胶, Invitrogen (可用自制 2%琼脂糖凝胶代替)

10. Phusion HF PCR 预混液, NEB, #F531S or #F531L

11. 来自Illumina测序试剂盒的接头混合物。可用经过快速变性缓 慢退火的接头混合物代替（见参考文献1）

接头序列如下:

5" P-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

5" ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

12. 来自Illumina测序试剂盒的 PCR 引物1.1 和2.1。可用普通合成的如下序列引物代替Illum1.1:

5"AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

Illum2.1:

5" CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT


仪器


1. BECKMAN公司离心机和转头

2. PCR仪(Perkin Elmer 或 Roche)

3. NanoDrop 微量紫外-可见光分光光度计


实验步骤


1. 纯化酒精沉淀的ChIP DNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒，用50 ul洗脱缓冲液洗脱。其中，34 ul用于文库构建，剩下的用于定量PCR检测。

2. 构建文库前，DNA需要稀释。纯化后用Nanodrop测定DNA的浓度。如果浓度是20ng/ul，稀释5倍; 如果接近40ng/ul，稀释10倍。

3. 末端修复：在1.5ml离心管中混合以下成分

34 ul 纯化的ChIP DNA (或补水至34 ul)

5 ul 10X 末端修复缓冲液

5 ul 2.5mM dNTP混合物

5 ul 10mM ATP

1 ul 末端修复酶


50 ul

室温放置45分钟。用QIAquick PCR纯化柱纯化，用34 ul缓冲液洗脱。

4. 3’末端加A。在1.5ml离心管中混合以下成分

34 ul 步骤3的ChIP DNA

5 ul Klenow缓冲液 = NEB buffer 2

10 ul 1mM dATP

1 ul Klenow 片段 (3’ à 5’ 外切酶活性)


50 ul

（1mM dATP用100mM dATP母液稀释，每管25ul分装，只能冻融一次）

用MinElute PCR纯化柱纯化，12 ul缓冲液洗脱。

5. 接头连接：在1.5ml离心管中混合以下成分

11 ul 步骤4的ChIP DNA

15 ul DNA连接缓冲液

1 ul 1:20 稀释的接头寡核苷酸

3 ul DNA 连接酶


30 ul

如果同时做多个重复，确保每个平行反应加入不同的接头，标记清楚。

6. 凝胶筛选除去多余的接头：

将6 ul稀释10倍的上样缓冲液加入到30 ul 第五步的反应液中，上样至两个E-gel胶孔中。另外取20 ul稀释10倍的50 bp DNA ladder上样。电泳20分钟。

切取大小在150bp到450bp之间的DNA，用QIAquick 凝胶纯化试剂盒纯化，30 ul洗脱缓冲液洗脱。

7. 用Illumina引物PCR：

用Gibco水将Illumina PCR引物1.1和2.1进行1：1稀释

在PCR管中混合以下成分

30 ul 步骤4的ChIP DNA

28 ul Phusion PCR 预混液

1 ul 稀释的引物 1.1

1 ul 稀释的引物 2.1


60 ul

PCR 循环:

98 °C 30 秒

98 °C 10 秒

65 °C 30 秒

72 °C 30 秒

GOTO step 2 for 15 次

72 °C 5分钟

4 °C

8. 2%琼脂糖凝胶上进行分子量筛选：

将1ul稀释的上样缓冲液加入到上一步的PCR反应液中，上样至三个E-gel胶孔中。另外分别取20 ul稀释10倍的50 bp 和100 bp DNA ladder上样。电泳30分钟。切取大小在150-450bp之间的DNA。切胶前后照相保存。注意不要切到100 bp左右的接头条带。高质量的文库应该包含集中在200bp左右的弥散状条带。如有100 bp左右的明显条带则说明接头过量扩增，降低了文库质量。用QIAquick 凝胶纯化试剂盒纯化DNA，用30 ul洗脱缓冲液洗脱。

9. 测定DNA浓度。用NanoDrop 测定所得DNA的浓度。高质量的文库应具有相当的浓度（> 10 ng/ul）


References


1. Lefrancois P, Zheng W, Snyder M. 2010. ChIP-Seq: Using next-generation sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods in Enzymology Vol. 470, Chapter 4, 77-104

2. Lefrancois P, Euskirchen G, Auerbach R, Rozowsky J, Gibson T, et al. 2009. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics 10: 37