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标题:[讨论帖]肿瘤细胞培养

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发表于 2012-2-2 14:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
微生物污染的排除


细胞受各种霉菌、细菌和支原体污染后，一般都较难排除或杀灭，其中以支原体更难排除，因此从预防着眼为上。



1） 抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体

1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。

3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。

4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。
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发表于 2012-2-2 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2） 加温除菌法

把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。



3） 动物体内接种除菌法

把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。



4） 巨噬细胞吞噬法

从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止
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发表于 2012-2-2 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
特殊培养法


1）二倍体细胞培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1. 吸除旧培养液注入另瓶中。

2. 用温BSS冲洗1次。

3. 用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4. 待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5. 轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6. 按一分为二比例接种培养。



2） 支持物培养法

加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。

1. 支持物制备：如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可；通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时—96%酒精30～60 min—蒸馏水浸泡30～60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。

2. 培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。
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发表于 2012-2-2 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3） 细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1. 消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2. 低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3. 接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

4. 标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5. 分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。



必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：

使用适应性培养基或条件培养基（Conditional Medium）。制备：

1. 培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。

2. 离心：3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。

3. 滤过：再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。



使用饲细胞(Feeder Cells)。制备：
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 小中大
1. 取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。

2. 在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3. 细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104（104细胞/cm2）接种入新培养基中。

4. 48小时后，即可用于细胞克隆之用。

ont-family: 'Times New Roman'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">制备浓度为1 mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底。

2. 倒出多聚赖氨酸溶液，用5ml PBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用。



4）球体细胞培养

1. 琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。

2. 取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。

3. 加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。

4. 换液：培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。



5）微载体细胞培养法

1. 微载体选择：先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到最大量细胞为佳。

2. 水化：称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50～100ml的比例，加入无Ca2＋和Mg2＋的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。

3. 消毒：可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。

4. 传代培养：在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA＋胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。
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 小中大
6） 悬浮培养法

悬浮培养是使帖壁细胞呈悬浮状态生长。如所需培养的细胞本身属悬浮生长型，则无须做任何处理；在传代时先做离心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养帖附型细胞时，必须进行干扰细胞不能帖附，方法有二：

1．用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能帖壁而成悬浮培养。

2．用试管培养细胞，把试管置入带有旋转鼓的特制温箱中进行培养，旋转鼓不停徐缓转动，干扰细胞帖壁遂成悬浮培养
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 小中大
常规组织培养法


1）初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
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 小中大
2）初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
3）传代培养法

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养
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 小中大
原代神经元培养



Protocol for the Primary Culture of Cortical and Hippocampal neurons
Solutions and media required:

Poly D-lysine/laminin solution - pdf
DM/KY - pdf
Optimem - pdf
Neuronal growth medium - pdf
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Set-up for the dissection:



Day 1:

Add poly D-lysine/laminin solution to culture dishes/coverslips. Swirl the plate to ensure that the coating mix covers the entire bottom of the plate. Leave the dishes/coverslips in the 37oC/5% CO2 incubator overnight.



Day 2:

Wash the dishes/coverslips twice with sterile water; remove the final wash and leave them liquid-free in the incubator.
Make up DM/KY, sterile filter and place on ice
Make up the trypsin inhibitor solution and the papain solution BUT DO NOT add papain at this point; place solutions on ice.
Pour ice-cold DM/KY solution into several culture dishes: 1 large dish for the pups and 10cm dishes for the pup heads, for the intact brains and for the dissected cortices. Place dishes on ice.
Obtain pregnant rat

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 小中大
Dissection of hippocampus and cortex:



Sacrifice the rat by placing a plastic dish containing dry ice in the cage and then pouring water into this plastic dish; cover the top of the cage with a bag.
After the rat fails to move spontaneously or in response to pain (touch the eye and look for a reflex), incise along the abodmen and remove the uterus. Place the pups into the large culture dish.
Remove the heads of the pups and place in a 10cm dish
For each head, remove the skin and cut along the scalp in the midline with fine scissors. Make a similar midline cut in the calvarium. Deflect the calvarium with a blunt spatula and scoop the brain into another 10cm dish containing ice-cold DM/KY.
Dissect the coritces: place the brain ventral side up. Place the spatula in the medial aspect of the ventral cortex and midbrain and cut the cortices off. Discard the midbrain.
Dissect the hippocampus and cortex: place a cortex medial side up and place the spatula into the lateral ventricle pushing forward through the lateral aspect of the frontal cortex. Extend the cut through the cortex inferiorly and superiorly to isolate the posterior half of cortex and hippocampus. Discard the remainder.
Dissect the hippocampus from the cortex: place the spatula in the lateral ventricle underneath the hippocampus. Make cuts superiorly and inferiorly to free the respective ends of the hippocampus. Roll out the hippocampus with the spatula and cut the hippocampus from the cortex near the dendate/entorrhinal cortex junction. Place the individual cortices or hippocampi in 10cm dish containing ice-cold DM/KY.
Add the papain to the enzyme solution before stripping the meninges (or 30min before anticipated completion of dissection) and place the papain and trypsin inhibitor solutions in a 37oC water bath.
Strip the meninges and cut the tissue into small 1mm3 pieces.
Sterile filter the papain and trypsin inhibitor solutions.
Transfer all of the cortical/hippocampal tissue to a 15ml conical tube. Use one 15ml tube per 5 cortices dissected. Once the tissue has settled remove the extra DM/KY solution.


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