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标题:[讨论帖]肿瘤细胞培养

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发表于 2012-2-2 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Papain treatment:



Add 5ml of the enzyme solution to the dissected tissue and incubate at 37oC for 15min, mixing every 5min.
After 15min, remove the enzyme solution and replace with a second 5ml of enzyme solution. Incubate for a further 15min with mixing at 5min intervals.
After 15min (total of 30min) remove the enzyme solution and wash with warmed DM/KY 3-4 times or until the tissue solution turns pink.


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Trypsin Inhibitor treatment:



1. Add 5 ml of trypsin inhibitor, mix the tissue and incubate for 5 min.

2. After 5 min, remove the trypsin inhibitor and replace with fresh 5 ml aliquot

3. Repeat a total of 3x / 15 min trypsin inhibitor treatment. Remove excess and was twice with 1 ml of Optimem / glucose.



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发表于 2012-2-2 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Trituration:



1. Transfer tissue to a 50 ml conical tube with 5 ml Optimem/glucose solution (3 ml for hippocampus).

2. Triturate gently with a 5 ml pipette until cloudy. Add 3-5 ml (1-2 for hippocampus) of optimem/glucose solution and allow the tissue to settle for a few minutes. Transfer 3-5 ml (1-2 for hippocampus) of cloudy supernatant to a second tube.

3. Repeat step 2 as many times as necessary to obtain adequate numbers of cells. Transfer supernatant from second tube to a third tube, taking care to avoid any small tissue bits that have settled in the interim.



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Plating cells:



1. Mix the cell suspension and transfer 10ul aliquot to a tube that contains 10 ul of DM/KY and 10 ul of Trypan blue. Mix thoroughly and count the number of cells in the 16 box squares in the 2 opposite corners of the field. Average the 2 counts or recount if the 2 numbers are different by more than 10%. Multiple the average by 30, 000 to get the number of cells per ml.

2. Dilute the cells with optimem/glucose solution to final count of 2.5-3 million per ml and plate 2ml per 60mm plate. After 2 hours remove the plating media (optimem/glucose) and replace with growth media.
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发表于 2012-2-2 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞学技术



概述及注意事项：

细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术，其来源先于组织切片技术，目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运用的范围也很广泛，如女性生殖系统、食管、胃、肺、浆膜腔积液、泌尿管道、鼻咽部等部位的脱落癌细胞，以及胸、腹腔的肿块、淋巴结、乳腺、和其它组织器官的细胞学诊断。

标本采集注意事项：：

1、要在较为准确病变的部位采集病变标本。
2、标本应及时处理，固定。以防止细胞自溶***。
3、避免异物掺入标本，如血液、粘液。
4、无菌操作，动作快，以防止并发症和扩散。

标本采集 ：

1、直接法：在女性的外阴、阴道等部位采集时，要求患者在取材前一天避免性生活，盆溶、阴道灌洗、涂药和月经期。此法可用鼻咽、眼结合膜、皮肤、口腔和肛管、咽管等部位。

2、磨擦法：使用工具如海绵磨控器、线网套和气囊等，用于鼻咽、食管、胃等处。
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发表于 2012-2-2 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3、自行分泌：

1）痰液：患者人深处咳出可疑痰液，如含有血液，立即涂片并固定。此法可用于呼吸道恶性病变，肺石棉沉着及肺霉菌感染等病。当出现嗜酸性粒细胞时也可用于过敏性哮喘的诊断参考。

2）尿液：以离心后取其沉淀物。

3）乳腺分泌物：于患处按摩挤出分泌物作涂片，或用针吸法后涂片检查。

4）前列腺液：按摩腺部取分泌物。

标本固定 ：

涂片在尚未完全干燥时，投入固定剂中固定。以防止涂片细胞脱落。一般时间为10-30min。常用固定剂可选用：95％乙醇、乙醚－乙醇（乙醚与95％乙醇1：1混合），20％甲醛，甲醇及Carnoy液

巴氏染色法：

试剂配制：

OG6染液 桔黄G0.5g 95％乙醇100ml 磷钨酸0.015g
EA36染液 0.5％亮绿SF水溶液15ml 0.5％伊红Y水溶液45ml 0.5％俾士麦棕水溶液10ml 磷钨酸0.2g 碳酸锂饱和水溶液1滴

染色方法

1、涂片固定后经梯度乙醇至水。
2、苏木素液染5－10min。流水冲洗返蓝。
3、OG6染液1-2min后，用95％乙醇洗两次。
4、入EA36或EA65染液2－3min。
5、用95％乙醇洗两次，分色。
6、梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：细胞核呈蓝色。表层扁平细胞质粉红色。中间与基底旁细胞胞质蓝至绿色
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发表于 2012-2-2 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞培养的一般技术


促细胞分裂剂激活单核细胞

基本原理 ：

本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。 细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。

表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂

促细胞分裂剂
所 用 浓 度
应 答 细 胞

刀豆蛋白A ConA
1- 10 μg/ml
T 淋巴细胞

植物凝集素PHA
1-5 μg/ml
T 淋巴细胞

佛波醇酯PMA
1-10 ng/ml
T 淋巴细胞

娄诺霉素+PMA
100-500 ng/ml
T 淋巴细胞

脂多糖LPS
2-25 μg/ml
鼠B细胞（T不依赖型），

单核细胞

美洲商陆PWN
试验测定
人B细胞（T依赖型）

葡萄球菌A，SAC
1/1000-1/10000
人B细胞


试剂和设备：

l 细胞悬浮液；

l 96孔平底组织培养板；

l 含血清培养基（通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

l 促细胞分裂剂（见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品；

l 多通道移液器和微量移液器；

l 带570nm滤片的酶标仪；

l 超净工作台；
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发表于 2012-2-2 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
l CO2孵箱；

l 冷冻离心机。

操作步骤：

（一） 促细胞分裂剂制备

根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液（如100´），保存于-20℃。

（二） 促细胞分裂剂滴定

1．在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10倍；

2．在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释（100 μl/孔）；

3．每孔平行重复三次；

（三） 细胞激活

1． 分离外周血单核细胞；

2． 室温下用培养液300´ g离心10分钟，收集并洗涤细胞；

3． 计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106细胞/ml，在培养板中每孔加入100μl；

4． 在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（细胞增殖需2-3天；细胞因子测定测定6小时-2天；免疫球蛋白分泌测定需5-10天）；

（四）细胞激活定量测定方法

1． 细胞增殖检测方法采用MTT测定法；

2． 细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒；

3． 免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测

对照试验：

1． 阴性对照：不含促细胞分裂剂的培养液为对照组；

2． 促细胞分裂剂没有阳性对照。通常利用滴定曲线进行预试验确定促细胞分裂剂的最佳浓度以及最佳培养时间。

实验要点及说明：

1． 促细胞分裂剂的计量应答曲线通常为钟形，并且高浓度的促细胞分裂剂其效果较差；

2． 尽量避免细胞浓度过低，不要采用圆底培养板；

3． 抗CD3和抗TCR抗体可以用于T淋巴细胞激活；

4． 偶联到小珠上的抗免疫球蛋白抗体可以用于B淋巴细胞激活。
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 小中大
第一节 细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

l 冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；

l 培养液；

l 台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；

l 70%乙醇；

l 组织培养瓶；

l 15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；

l 离心机；

l 血球计数板；

l 超净工作台；

l 光学显微镜；

l 37℃水浴；

l 冷冻管；

l -80℃冰箱；

l 液氮和液氮容器。
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操作步骤：

（一）冷冻细胞

1． 收集对数生长期细胞；

2． 以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3． 细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟；

4． 将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5． 将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6． 将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7． 24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8． 在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1． 将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2． 当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3． 将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4． 细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟；

5． 弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6． 将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7． 是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。
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 小中大
对照试验

在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。

实验要点及说明：

1． 严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害；

2． 对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管；

3． 延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快；

4． 细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；

5． 每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行；

6． DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度；

7． 如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复；

8． 也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。

第二节 支持物培养法培养贴壁细胞

基本原理：

通过在支持物（如盖玻片）上培养贴壁细胞，可以应用抗体检测细胞表面抗原的表达或进行酶细胞化学以及免疫细胞化学检测。该方法的优点是细胞贴壁牢固，能够维持细胞生长时的状态。
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 小中大
试剂和设备

l 细胞悬浮液；

l 6孔平底组织培养板，或φ60 mm培养皿；

l 18mm x 18mm 或20mm x 20mm浸于75%乙醇中的盖玻片；

l 含血清培养基（通常为 RMPI 1640,含10% 小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

l 超净工作台；

l CO2孵箱；

l 盖片镊；

操作步骤：

1． 用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2． 将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；

3． 在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4． 将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；

5． 将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

实验要点及说明

1． 本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；

2． 所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；

3． 盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；

4． 如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；

5． 如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干
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