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标题:[讨论帖]肿瘤细胞培养

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发表于 2012-2-2 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十五、染色体分带技术
　　染色体显带技术是在显示染色体基础上发展起来的技术，其优点是能显现染色体本身更细微的结构，有助于更准确地识别每条染色体及染色体异常疾病。染色体分带技术能适用于各种细胞染色体标本。
　　染色体显带是沿着整条染色体的长轴，能显现出着色深浅不同、横向走的带型。目前认为染色体显带现象是染色体结构所致。但用特殊方法处理后，再用染料染色，则带型更加清晰，随显带方法不同，显现出的带型的特点也不一样，这说明带的出现与染料的特异结合相关。人类染色体能显现出近2000个G带，这些带再融合成一般显微镜下可见的850条左右的高分辩染色体带型或350条带左右的常规带型。
常见的几咱显带方法：
（一）、G带
　　也称为G显带，是最常用的显带方法，具有操作简便、经济及标本能长期保存等优点。
1、Giemsa原液的配制：
　　（1）称3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少许丙三醇研磨，研磨越细越好；
　　（2）将研细的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶内，丙三醇的总量为250ml，用一定量甲醇洗干净研磨器。
　　（3）摇匀，置60℃水浴锅24小时或37℃温箱72小时，经常摇动。
　　（4）取出冷却后，加甲醇总量至250ml混匀，密封棕色瓶备用。贮藏时间越长，染色效果越好。
2、实验材料：
　　中期染色体标本；
　　0.9%氯化钠注射水；
　　3%tris液体；
　　0.25%胰蛋白酶；
　　Gremsa染色液；
　　蒸馏水；
　　水浴锅；
　　立式染缸；
　　定时器或时针；
　　温度计；
　　镊子及纱布；
　　刻字笔；
3、操作程序：
　　（1）消化液配制：取0.9%氯化钠注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶盐水消化液，加4-5滴tris液调PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴锅中备用；
　　（2）染液配制：取立式染缸，加蒸馏水500ml，加3滴tris液调PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管调匀备用；
　　（3）漂洗液：取立式染缸一个，内加蒸馏水备用；
　　（4）试消化：待消化液温度在37℃左右时，取同批标本较多者标本1张，分二节或三节进行消化，每节相差十五秒左右，从45秒或60秒开始增减。取出后先在纱布或吸水纸上直立除去带出胰蛋白酶，后置蒸馏水染缸内漂洗，取出后，标本斜面朝上，刮去染色缸内染液上浮膜，沿槽插入，每分钟移动1次，染色3-5分钟。
　　（5）洗片：从染色缸中取出标本玻片，自来水冲洗，取刻编号面朝上用纱布干净玻片背部染色，稍干，高倍镜下观片，确定分带与染色时间。
　　（6）分带：取4张待分带标本玻片，细胞面朝左侧按顺序插入37℃的消化液中，消化时间较试消化选择时间延长5-10秒钟，取出每片间隔时间约10秒钟左右。
　　（7）消化及染色调整：每次消化完一批标本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化时间不变。同样，每次染色一批标本后加Giemsa染色液2-3滴，调匀，每次染色时间不变；
　　（8）Giemsa染色调整：若Giemsa染色标本偏红，说明染色液偏酸，可加tris数滴调蓝，若Gremsa染色标本偏蓝则说明tris加多了；
　　（9）保存：将分好带的及观察中的标本及时收集于玻片盒内保存，防止细胞涂面灰尘污染及擦损。
　　注意：Giemsa消化染色过程中，有两个重要的环节，一是胰酶消化环节，消化不足带不出现，消化过度染色体变得膨胀和不着色，必须把握好胰酶浓度、消化时间和消化温度；二是预处理或老化环节，对消化和带型清晰度有很大影响，其中80℃2小时热处理，是简便易行和效果较好的办法。
（二）姐妹染色单体分化染色
　　姐妹染色单体差别染色可使中期染色体显示深浅不同的两条单体，能借以观察姐妹染色单体互换（SCE）现象。SCE是两条染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互换而表现出来一种现象。即是细胞分裂是DNA同源重组的结果。SCE既是一种无害的变化（有生理波动），也可受射线、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映细胞的损伤与修复状态。
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发表于 2012-2-2 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、原理：
　　在细胞培养过程中，加入一定是的5-溴脱氧尿苷（BudR ）,当细胞在DNA复制过程时，BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此，当细胞处于第二个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BudR的DNA链构成，而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低，故对染色剂亲合力低，在用Giemsa染色时其单体着色浅，只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。
2、BudR贮存液的配制：
　　BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
　　然后加蒸馏水至 5ml
　　即成1000ug/ml的贮存液，因BudR遇光会发生分解，贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。
3、实验材料：
　　所检培养细胞；
　　BudR贮存液；
　　2×SSC液；
　　常规染色体制片所需物品；
　　水浴锅；
　　20W紫外灯一个；
　　培养皿；
　　镜头纸；
4、操作程序
　　（1）BudR掺入：细胞培养24小时后于培养液中加入BudR，最终浓度5-15mg/ml，避光条件下继续培养。
　　（2）终止培养：待细胞经历两个细胞周期（48小时），培养终止前3小时加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02ug/ml培养液；
　　（3）常规制片及烤片；
　　（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿，移入50-60℃水浴锅内，紫外线灯距离5cm，照射30-40分钟；
　　（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟；
　　（6）洗片及存片：同G带片
　　注意：BudR是一种强突变剂，使用浓度不宜过高，否则会产生细胞毒性作用。
（三）染色体脆性部位（fra）
　　脆性位点也称危性部位，是在一定的培养条件下人类染色体上某些特异位点非随机地表现出的裂隙和断裂。脆性部位分为普通型和罕见型两大类。
1、实验材料
　　（1）常规外周血所用物品。
　　（2）培养基是用不含叶酸的MEM-Fra培养基或低叶酸的CT199培养基。
2、培养液配制
　　MEM-Fra 90-95%
　　小牛血清 5-10%
　　双抗 100u/ml
　　PH调至7.5左右
3、操作程序
　　与制备外周血的染色体方法相同。
　　注：脆性X综合症：（FraX）
　　这种染色体改变是在1969年被发现，1977年被定位于Xq27、记录为fra（X）（q），并命名为脆性部位。X连锁智力低下（MR）与fra（X）（q27）密切相关。FraX的发生率占新生儿的1/2500；占X连锁MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其发生率仅次于先天愚型。
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发表于 2012-2-2 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞培养基本技术--幻灯片版（625K）

www2.zzu.edu.cn/cancer/ppt/细胞培养基本技术.ppt
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发表于 2012-2-2 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在日本网站上找到了CHO细胞的培养方法，现译成汉语，希望对大家有用。
ＣＨＯ细胞培养方法（正统法）
译者：freechange 2004/11/16
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※准备
・DMEM培养基
・PBS(-)
・Trypsin（0.25％）
・MTX（100μM）
・移液管
・自动移液枪
・废液缸
※培养基量
　25 ｃ㎡・‥‥5　ｍｌ
　75 c㎡・‥‥10　ｍｌ
※操作顺序
① 把培养瓶内的培养基用5ml的移液管转移到保存用的离心管里。
② 用培养液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗细胞表面（2次）。
③ 再用培养液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶冲洗细胞表面
④ 再CO2培养厢里静置5分钟。（利用这段时间，准备好15ml的大离心管，并也好标签做好记号。）
⑤ 物理方法处理，（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离，再用显微镜确认是否完全脱离。
⑥ 加入等倍量的（25ml‥5ml）培养基，充分冲洗培养瓶内表面，在连同细胞全部转移到大离心管中。
⑦ 离心分离（1,000rpm、4℃、10min）。（这段时间准备新的培养瓶，按照9/10的量（25ml‥ 4.5ml），加入培养液准备好。加入MTX的同时加入。）：　50 nM MTX: 2.5 ul of 100 uM/final 5 ml 培养液
　 （这期间，要在培养瓶表面写上细胞培养的诸多条件和细胞的种类等等。）
⑧ 离心分离后，为了避免沉淀细胞扩散到溶液里，要迅速将上清用吸管吸除。
⑨ 加入培养液(DMEM+FBS, 25ml‥5ml)，用移液管充分混匀细胞。
⑩ 按1/10量，（25ml‥0.5ml）将细胞悬浊液注入新培养瓶中。
⑪ 在CO2培养厢中37度条件下培养。培养液总量为５　ｍｌ
注：使用的移液管为培养专用玻璃移液管，在上面吸口处，塞上棉花经过干热灭菌的。干热条件：１８０℃、　３小时。

以下是日文原稿：
ＣＨＯ細胞培養方法（正統法）
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发表于 2012-2-2 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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※準備するもの
・DME・M培地
・PBS(-)
・Trypsin（0.25％）
・MTX（100μM）
・ピペット
・オートピペッター
・廃液入れ
※培地量
　25 ｃ㎡・‥‥5　ｍｌ
　75 c㎡・‥‥10　ｍｌ
※手順
① フラスコ内の培地をpypette(5 ml)で保存用のチューブに移す。
② 培地の1/2量（25・‥2.5・）のPBSで細胞表面を洗う（2回）。
③ 培地の1/10量（25・‥0.5・）のTrypsinで細胞表面をリンスする。
④ CO2 incubator 内に5分間静地。（この間に、グライナーチューブ15 ml
　 を用意しておく、マークおよび標品名を記入）
⑤ 物理的処理（フラスコの横をたたく）により、細胞を剥がす。顕微鏡で細胞
　 のほぼ完全な剥離を確認する。
⑥ 等倍量（25・‥5・）の培地を加え、フラスコ表面を十分にリンスし、
培地をグライナーチューブに 全量移す（細胞が含まれている）。
⑦ 遠心分離（1,000rpm、4℃、10min）。（この間に、新しいフラスコを用意し、9/10　　量（25・‥ 4.5・）
の培地を入れておく。MTXを加えるときも、このとき入れておく）：　50 nM MTX: 2.5 ul of 100 uM/final 5 ml mdium
　 （この間にフラスコの表面に細胞培養の諸条件と細胞の種類等を記入する）
⑧ 遠心分離後、沈殿細胞の溶液内拡散を避けるために、急いで上清をデカンテーションで 除く。
⑨ 培地(DME+FBS, 25・‥5・を加え、ピペットで十分に細胞を懸濁する。
⑩ 1/10量（25・‥0.5・）の細胞懸濁液を、新しいフラスコに注ぐ。
⑪ CO2 incubator, 37C にて培養。：培地総量は５　ｍｌ
以上 お疲れさまでした。
備考：　ピペットは培養用ガラスピペットの口元に綿を詰めピペット缶に入れ乾熱したものを
　　　　　使用する。乾熱：　１８０℃、　３時間
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