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标题:[求助]请教细胞线粒体分离方法．

pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

线立体是在哪步被破碎的呢？完整的线立体可以做western么 ?
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发表于 2012-2-7 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在整个线粒体的提取过程中都要尽可能保证线粒体不被破坏!当然要用完整的线粒体来做Western!作Western时加入裂解液后线粒体就破碎了!
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提取到完整的线粒体后，用MS缓冲液悬浮。此时线粒体还是完整的，怎么测定蛋白浓度呢？
是不是MS缓冲液就可以把线粒体破碎呢？
还是线粒体沉淀不要用MS悬？而是用另外的裂解液呢？最后悬线粒体的不是MS缓冲液吧？裂解液应该和平时提取细胞总蛋白的一样才对吧？
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发表于 2012-2-7 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是检测细胞色素C啊！
1、你用的蛋白酶抑制剂是“胃蛋白酶抑制剂”还是“胰蛋白酶抑制剂” 呀？都一样么？
2、甘露醇临床用的不行啊，有哪家试剂公司卖？
3、没有dounce匀浆器怎么办？
我怎么这么惨？什么都没有？在我们这里当研究生真是太郁闷啦！！
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发表于 2012-2-7 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.两个都加了；
2.随便找个试剂公司，买一瓶至少是分析纯的甘露醇。临床用的没试过；
3.只好问别人借了，我用的是2ml的匀浆器，不过现在不在我手上了～～
4.提完线粒体后如果马上进行Western，可以不用MS缓冲液，直接用Western蛋白裂解液裂解；如果不能马上进行试验，最好还是保存在MS缓冲液中。
5.用Bradford法或福啉酚法测定蛋白浓度，一般的生化试验指导书上都应该有的！
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发表于 2012-2-7 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问两种蛋白酶抑制剂都加，是每种1微升么？
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发表于 2012-2-7 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，如果不马上做western。那蛋白质都包在完整的线粒体里，怎么能测定蛋白质浓度呢？
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发表于 2012-2-7 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两种抑制剂我是按照分子克隆第二版Western裂解液配方中的浓度加的，其实过量一点好像关系也不大！
一般我在作Western之前测蛋白的浓度；
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发表于 2012-2-7 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白质不是可以保存在-20度么？为什么偏偏不能将线粒体裂解后保存其蛋白，而一定要完整的保存？
每次做western前都要裂解一次线粒体，然后测定蛋白质浓度，不是既麻烦又没必要吗？
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发表于 2012-2-7 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将线粒体裂解后保存其蛋白也可以,不过还是尽快作Western,时间长了蛋白还是会降解的;
如果嫌麻烦,可以测定同一批次的线粒体蛋白浓度,然后保存;我觉得每次做western前测一下蛋白浓度更好一些.
以上为个人意见,仅供参考.
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