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标题:[讨论帖]原代细胞培养交流

zzzz[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助___培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们?
有人说.用胰酶消化以后,两种细胞贴壁有快慢:成纤维细胞贴壁快,平滑肌细胞贴壁慢,靠掌握时间将它们分离开.
上面的说法是否正确,那么消化后,(细胞贴壁过程中)该在多少小时以后将悬浮液转移,另外培养,才能得到比较纯的平滑肌细胞???

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成纤维细胞比较常用的分离方法就是差异贴壁法以及消化法，但是具体的细节需要根据你用的分离条件以及细胞种类来摸一下，还有的文献说，成纤维对低血清耐受力较差，如果你的平滑肌细胞可以的话（没养过不太清除），可以试着降低血清的浓度，传几次试试看，我感决要几种方法一起用，成纤维实在是太皮实了
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养心肌细胞，大鼠乳鼠的，应用差速贴璧法并未取得较好的效果。
因为成纤维细胞的存在可以支持和营养心肌细胞。所以差速贴璧后心肌细胞长得没有混合培养好，不知各位同仁战士意见如何，怎样才能有效地纯化心肌细胞呢？
我也养大鼠乳鼠的心肌细胞，只使用很普通的方法 不之对你有否帮助

(1)对小鼠消毒
(2)断头 取心脏
(3)置于一无血清培养液中 用眼科镊子剥离心包膜 一定要彻底 同时把心脏的大血管也拨出
(4)将剥好的心脏沿长轴剪成两半
(5)置于以离心管中 用消化液消化 37水浴 30分后吸去上清
加入新的消化液 37水浴消化 5分钟摇一摇 15分用吸管吹一吹 加快消化的速度
(7)等到细胞块基本消失 消化液变浑 离心1500转12分 弃上清
加入培养液吹打成单个细胞 放入培养板!!
(9)OK
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yes4[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做肿瘤组织的原代培养,请问那位有经验.大概多长时间可以长出细胞?
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养细胞的过程非常艰苦，现在我培养细胞有时候还是有问题呢。在实验中也多少有点自己的体会和经验，希望战友们可以借鉴。细胞培养成功中间有很多步骤可能出问题。我做了那么多次，把我失误的地方告诉大家，希望你们在实验的过程中尽量避免。.我培养的细胞不能分裂增殖，不可以传代，因此培养起来非常难。

1.首先出现的问题就是细胞在24小时候不贴壁，换液之后没有多少细胞了。后来就用了多聚赖氨酸。
2.贴壁解决了，但是又出现细胞总是在换液后24小时左右状态不好。于是怀疑是不是污染，但是发现培养基也没有变混浊。考虑可能是消化过程不过彻底或是消化时间过长，相应的就调整了一下。
3.有时候污染，有时候也长过霉菌，但是自己觉得自己的操作应该没有问题，有时候实在找不到原因，就更加谨慎的操作或是看一下别人的操作过程。后来有改进了一些。培养箱我每培养完一次就重新清洗一遍。
4.再就是其他条件都没有什么大的问题，细胞就是不大好，最后再发现自己的细胞对ph值非常敏感，喜欢7.0左右。别人的细胞自从配了培养基以后从来没有调过ph值，细胞照样非常健康。而我每次都要调，现在练得知要一看颜色就知道ph值是多少。
5.至于传代，我的细胞不用，但是胰酶的消化时间还是不要长了。我曾经试着把细胞消化下来继续在另一个培养瓶培养，但是细胞几乎不怎么贴壁，而且长得也非常差。
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发表于 2012-2-8 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，马上就要自己养细胞了，也已经看了不少实验，学了一点基本的细胞培养知识，可是真的要自己做起来还是会碰到很多实际问题的，而且，这种事情是要靠经验的，所以，很高兴能有这样交流经验的版块，以后要常来啊！！
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发表于 2012-2-8 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠:说来惭愧,我养小鼠血管内皮细胞,(那小鼠主动脉血管只有1MM粗,好在我外科技术还行).反复多次,尝试过消化法,组织块法,胎牛血清也用了,可以说除了自己没技术,其他的实验条件都不错.到处取经,就是没结果.时间紧迫,想买细胞株,只有进口的,价格跟拦路打劫差不多.恳请各位高手指点一二
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发表于 2012-2-8 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做淋巴管内皮细胞的原代培养，做的是大鼠，但胸导管还是小。按照我国某医学高校的组织块法不成功，现在用发表在NATURE的消化法，希望有同行能交流
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wsll[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养箱里托盘中的无菌水记得要每周换一次，一般就不会有什么污染。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养的是大鼠卵巢颗粒细胞,方法是将卵巢表面的卵泡刺破,释放出颗粒细胞,但培养的细胞总是圆圆的,并不像文献上说得变成多角形,且24小时换液后,加入处理因素(含药大鼠血清)后,细胞的生长情况就很差,背景中有许多小黑点.
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2012-2-8 11:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我养的是大鼠卵巢颗粒细胞,方法是将卵巢表面的卵泡刺破,释放出颗粒细胞,但培养的细胞总是圆圆的,并不像文献上说得变成多角形,且24小时换液后,加入处理因素(含药大鼠血清)后,细胞的生长情况就很差,背景中有许多小黑点.

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如果是GIBCO的血清，黑点可能为血清中一种黑胶虫。另外，可能是药物导致细胞生长状况不佳，待细胞状况稳定以后加药。另外，建议用Hank's液洗细胞，离心2000rpm 10'，每次洗可筛除不好的细胞。留下健康细胞。稳定2周后，可做药物处理。
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