[求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？ - 经验共享

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标题:[求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？

misswu61[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我也要测细胞中的活性氧水平，能不能把相关参考资料发给我，我的邮箱是zmz2005052@126.com 谢谢！
我现在使用南京建成的H2O2检测试剂盒，但结果不理想，有谁使用这种方法吗？能不能传授下经验？
还是有更好的检测细胞产生的活性氧水平的方法？
望请赐教，谢谢

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教:
我也要使用DCF测脂多糖(LPS)刺激细胞的ROS产生,但每次处理完后在荧光显微镜下观察,对照组也有很强的荧光,几乎看不出和LPS刺激组的区别,我看文献上别人的对照组都是很弱的荧光,为什么我的就会这么强呢? 我也使用过专门测线粒体内ROS的一个染料(MITO-SOX),同样也是对照组很强的荧光.真是把我头都搞大了,反复了很多次了,没什么变化,所以作过相关实验的高手指点下小弟,不胜感激!!!
我的操作步骤是:LPS组,加1或10μG/ML的LPS;对照组加培养基,一个小时后去掉液体.加20μM的DCF染料,孵育30分钟后用PBS洗三次,然后在荧光显微镜下观察.

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发表于 2012-2-8 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用了碧云天的活性氧试剂盒，严格按照其说明书操作，但无论在荧光显微镜还是流式检测，发现阴性对照（装探针后不加刺激）和阳性对照（用其试剂盒内的阳性刺激1：1000）没有差别，镜下都有绿色荧光（细胞内），流式阳性细胞比例（2.9，3.1），阳性对照浓度提高到1：100，镜下绿色荧光无差别（细胞内），流式阳性细胞比例（2.9，4.1），到细胞点图仍是一团细胞，阳性对照浓度提高到5：100，镜下绿色荧光无差别（细胞内），细胞大部分标器或碎裂或法测流式了。
求高手指点！

hyuu[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、"活着真累"提到的对"阴性对照"的处理是不对的.所谓"阴性对照"是不加探针不加刺激的对照组，目的是检测下细胞本身荧光本底的大小，因为流式给出的荧光数值是相对的，阴性对照的值可以作为一个坐标零点看待；
2、不给刺激只加探针的处理组应为“正常对照”，因为没有接受刺激的细胞也是有ROS产生的，用探针标记后会有荧光显示很正常的。该对照是为了观察你的刺激对细胞ROS产生的影响。
3、“阳性对照”是为了检测整个探针标记系统是否存在问题，就我的经验，只要阳性对照有荧光显示，高与低对实验都没有太大影响。

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发表于 2012-2-8 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在正常对照虽然有荧光显示,但应该不是很强啊,我看文献上的就是很弱的荧光.但我的正常对照却有很强的荧光,和刺激组的都看不到什么区别,肯定是哪里出了问题,还请高手指点啊

loli[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上说的阴性对照我也做过流式，和正常对照仅是数值上的区别（阴性1.9/正常2.9），细胞点图都是一堆，镜下未观察。
现在关键是如何做出阳性对照和正常对照镜下的明显区别以及流式点图的区别，因为我的条件刺激和正常对照、阳性对照无论镜下还是流式都差不多，我不知道是否显著刺激了活性氧的产生。

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发表于 2012-2-8 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我做的 BV－2细胞，正常对照和刺激组的都有很强的荧光。

附件

2012-2-8 17:28

39072000.jpg (40.82 KB)

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发表于 2012-2-8 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

而且很多细胞就是一团荧光，对不准焦，形态不清晰。
以前看过一高手做的不管荧光强弱，都很漂亮。现将他的图片发上来和我的对照一下。
区别实在是太大了，
请各位高手指点啊！！！

附件

2012-2-8 17:28

32894399.jpg (70.78 KB)

october7[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我做的 BV－2细胞，正常对照和刺激组的都有很强的荧光。

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你的dcf用的是多大浓度，建议你减低浓度试试~~

dog002[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说的阴性对照我也做过流式，和正常对照仅是数值上的区别（阴性1.9/正常2.9），细胞点图都是一堆，镜下未观察。
现在关键是如何做出阳性对照和正常对照镜下的明显区别以及流式点图的区别，因为我的条件刺激和正常对照、阳性对照无论镜下还是流式都差不多，我不知道是否显著刺激了活性氧的产生。

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如果你做了流式，我想知道你的正常对照又没有阳性峰出现~
阴性对照一般只有一个阴性峰，而正常对照等会有阳性细胞出现，各组间阳性率以及峰值会有差异，我不知道你的到底是个什么情况~

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