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标题:[求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？

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发表于 2012-2-8 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是10μM的DCF，先用乙醇稀释DCF粉末，制成10MM的DCF溶液，然后用培养基稀释到使用浓度。
在荧光显微镜下观察，细胞就是一团荧光，对不准焦，形态不清晰。
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发表于 2012-2-8 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教各位大虾，我也作流式定量测定单个核细胞内ROS的含量，买的是碧云天的试剂盒，严格按说明书操作，结果在电脑显示是比较理想的，荧光也很强，但我发现，同一类病人，作出的结果往往相差很大。同一个人的标本，不同批次去测，结果也相差很大。
请问流式测定ROS，最后的结果如何分析。是只需要平均荧光强度吗，还是和细胞数量也有关系。谢谢
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发表于 2012-2-8 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也用的碧云天的活性氧试剂盒，并且按说明书步骤做的，可是为什么我加了阳性对照后依然看不到绿光呢？而且好像加了阳性对照的细胞死亡的很多，我的细胞是HL-60细胞（一种悬浮细胞），DCFH-DA的浓度是10微摩尔/升，1ml的细胞液中加了阳性对照1微升，用蓝光激发的。希望大家能帮我解答。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也打算做活性氧的试验，想找说明书看一看。可是最近碧云天的网站上不去了，给指点一下怎样才能上碧云天的网站吧 。或者其它的网站也行。谢谢！
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发表于 2012-2-8 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在作活性氧检测，现在还是不太明白阳性对照组如何做，是只加活性氧和探针吗？怎么用流式检测呢
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议直接购买SIGMA的DCFH-DA，380元左右吧，荧光效果相当好。
我们同一实验分别采用了碧云天的试剂盒和SIGMA的DCFH-DA粉剂，结果碧云天的荧光弱，而且组间无差别，用sigma的粉剂自己配置DCFH-DA溶液，一次出结果。有时图便宜反而更费钱啊。

SIGMA的DCFH-DA粉剂建议合买，一个人根本用不完。
取所需分量（够自己实验用的）直接用无血清培养基溶解即可，勿需任何溶媒处理，溶解性非常好。短期可4度保存。

我实验中是长期刺激细胞（10h），所以干预后才装载探针，终浓度10uM或20uM都可。贴壁状态下直接装载，避光孵育30min，PBS洗2遍，消化至悬，上流式检测。荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-2-8 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果浓度太大，在荧光显微镜观察时，就会造成没有差别，都是一片强荧光。我稀释到1UM，结果挺好的。可以用点双氧水刺激一下，但注意要充分洗涤，做个对照，就能摸出最佳的浓度了。
至于流式，做起来也很简单的。调好对照就行了。
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发表于 2012-2-8 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好，我也准备做这方面的实验，我想咨询一下相关问题。我的细胞也是长期刺激细胞（12h）,所以要干预后才装探针，但是我的阳性对照是买的碧云天的rosup需要在上机前半个小时加入，那我阳性对照组能不能先装探针再加rosup,这个顺序和sample的顺序不同可以吗？还有其他可以解决的途径吗？另外，贴壁细胞消化后需要离心用PBS洗吗？还是可以直接上机啊，我用荧光酶标仪测的话也需要消化后PBS洗吗？
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发表于 2012-2-8 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看了那么多 有个问题不太明白 用流式测完以后 得到了 mean值，最后如何统计这个数据 ？
一般采用 增加倍数（increase folder）作图，但是 怎么算出来呢? 是 实际值/阴性对照 ？

还是都需要减去本底 也就是 只有染料没有细胞？ 不太明白 求高人指点
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发表于 2012-2-8 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是不是不同的刺激时间这个荧光剂加入的时机是不一样的？我的需要刺激24小时
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