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标题:[讨论帖]细胞损伤模型

yysr238[使用道具]
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61
 

照射的时间很短,8s。
我们主要做的是眼科的rpe细胞。
观察紫外对眼部细胞的损伤作用以及一些药物的保护作用!
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guagua[使用道具]
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62
 
内皮细胞损伤模型
一、细胞因子损伤模型
将内皮细胞铺板后待即将单层融合时,换无血清或低血清培养基,加入细胞因子如IL-2,TNF-alpha、IFN等,共同孵育一段时间,或者加入药物与之共孵育,或者加细胞因子之前先加入药物孵育后,再加细胞因子,结束后测一些指标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因子损伤的保护作用。也可采用不同的时间、不同的浓度来观察。
二、缺氧-再供氧损伤模型
也是先将内皮细胞铺板后待即将单层融合时,换无血清或低血清培养基,先将细胞置于95%N2和5%的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保持37度的温度,用耗氧仪持续监测缺氧槽中的氧分压,使之保持在0.5 KP左右,细胞在低氧环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境,可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮细胞形态功能的影响,也可结合药物观察,入上所述。
此外,内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等。最后提及一点,楼上说的ox-LDL损伤模型的浓度不是很准确,因为从目前国内外的文献来看,oxLDL(10-50ug/ml)的浓度一般不会损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系,如ECV304,恰恰相反,的浓度的ox-LDL会促进细胞的增值,国内有人报道,ox-LDL造成ECV304凋亡的浓度一般为150ug/ml~200ug/ml,也有用100g/ml的。

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在细胞因子损伤模型中,为什么要无血清和低血清培养呢?有些细胞太娇弱了,在这样的情况下很容易调亡!请问如果在正常培养情况下直接做细胞因子损伤模型可不可以呢?
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yes4[使用道具]
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63
 

神经胶质细胞的制备和培养
1)取新生一周内大鼠,碘酒、酒精浸泡消毒后快速断头;
2)用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨,分离皮肤和颅骨时用不同的器具,弯剪剪取部分大脑皮层至60mm培养皿,培养皿内提前放置D-Hanks溶液;
3)解剖镜下取出脑膜及血管,转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿,将组织剪碎为1mm3左右的小块,然后小心转移至带螺帽的离心管内;
4)0.125%胰酶消化15-30分钟,以含10%胎(小)牛血清的DMEM培养基终止消化,巴氏吸管吹打,100目筛网机械过滤,制备混合细胞悬液;
5)计数,调整细胞密度,根据需求按适当密度种植于培养瓶或皿内;
6)放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱,2-3天后换液,去除死亡及未贴壁细胞,以后每3-4日换液一次;
7)约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加用二丁酸环腺苷(dBcAMP,0.25mmol/L),该物质被认为有促进细胞分化和抑制小胶质细胞生长等作用;
8)根据细胞生长状况对培养细胞进行传代,多数文献建议用传代3-5次的星形胶质细胞进行实验,但一般不在换液或传代的当天;
少突胶质细胞和小胶质细胞的培养尚需在星形胶质细胞培养基础上进一步纯化,具体可参阅McCarthy和Giulian等的方法。
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dongdongqiang[使用道具]
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64
 
请教:在血管内皮细胞敢于试验中,选择第几代的细胞有没有什么标准和规定呀?有谁能够指点一下??

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原代细胞在传代、培养过程中,会改变细胞的某些特性。
所以用于实验的细胞最好不要超过5代,并且全部实验都用同一代的细胞。
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is2011[使用道具]
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65
 

2型糖尿病大鼠动物模型

1. 高脂+STZ法:

SD大鼠购进后,适应环境2周。随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+STZ组,每组10只。
正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋白质13%,脂肪40%,其他7%。糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射STZ15mg (kg·bw),其他两组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。注射STZ前及注射后10d,分别测体重(BW)、空腹血糖(FBG)、甘油三脂(TG)、胆固醇(CH)、胰岛素(FSI),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10~12h,尾静脉取血后(0h),给予葡萄糖2g (kg·bw)灌胃,然后0.5、1及2h尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳+四氧嘧啶法:

脂肪乳的制备 猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1 g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶(两次给药
法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注
射四氧嘧啶100 mg·kg - 1) 。注射容积为0.2 ml·kg - 1 。
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2型糖尿病大鼠动物模型

1. 高脂+STZ法:

SD大鼠购进后,适应环境2周。随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+STZ组,每组10只。
正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋白质13%,脂肪40%,其他7%。糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射STZ15mg (kg·bw),其他两组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。注射STZ前及注射后10d,分别测体重(BW)、空腹血糖(FBG)、甘油三脂(TG)、胆固醇(CH)、胰岛素(FSI),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10~12h,尾静脉取血后(0h),给予葡萄糖2g (kg·bw)灌胃,然后0.5、1及2h尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳+四氧嘧啶法:

脂肪乳的制备 猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1 g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶(两次给药
法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注
射四氧嘧啶100 mg·kg - 1) 。注射容积为0.2 ml·kg - 1 。
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请教一下缺氧罐的简易制法是?
另外,由于阿糖胞苷要3个星期才能到,所以选择了Neurobasal/B27无血清培养,不知这样选择对于新手来说是不是把成功率降低了?
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Langendorff离体心脏缺血再灌注方案
采用美国Radnoti公司Langendorff离体心脏灌流系统,观察离体心脏功能变化,可排除其它组织器官、循环代谢产物的干扰。
实验步骤:
A.  配制37℃ K-H液(1.25 CaCl2,130 NaCl,5.4 KCl,11 葡萄糖,0.5 MgCl2,0.5 NaH2PO4及25 NaHCO3),向K-H液中通入95%O2-5% CO2气体,缓冲液PH 值为7.4,并取部分K-H液放入冰箱中,使其温度降到4℃。
B.  清洁Langendorff管路,每次使用前先用1000ml蒸馏水冲洗,打开水浴循环,再用K-H液将整个管路系统进行冲洗。
C.  鲁米钠腹腔注射麻醉动物(100mg/kg),并向肝静脉注射100IU肝素,颈动脉放血处死动物,同时快速分离心脏,放入4℃K-H液中挤净血液并称重。
D.  将心脏迅速固定在Langendorff 灌流系统中,通过主动脉以85cmH2O压力逆行灌注,通过肺静脉插入导管至左心房。
E.  心脏复跳后,将一个球囊插入心脏左心室,球囊和压力换能器相连,在电脑上记录左室内压,调整左室舒张内压(LVEDP)在4~10mmHg之间。待心脏左室收缩压(LVESP)稳定后且大于80mmHg,心率大于200次/分,可继续实验,并记录心电图(ECG)、主动脉流量(AF)、冠脉流量(CF)、左室收缩末压(LVESP)等指标。
F.  缺血再灌注方案:关闭灌流液,停灌心脏45min后,打开灌流液进行复灌90min(复灌起始15min通过肺静脉给予一定的压力辅助),同时记录相关指标。
G.  实验结束后,用蒸馏水冲洗整个管路系统,防止K-H液残留在管路中。
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血吸虫型肝硬化模型制备
因为我在武汉,所以我们导师和实验室对血吸虫导致的肝损伤有研究,现详述成熟的肝硬化模型制备方法

所选动物:大耳白兔,体重1-3KG。

复制方法:采用腹部敷贴法感染采自钉螺的血吸虫尾蚴。兔腹部剪毛,约1CM2,滴以含尾蚴液,使每只兔感染180-200只尾蚴,玻片覆盖15MIN,形成机型感染,3个月后形成血吸虫性肝纤维化。

模型特点:肝内门静脉分支与门脉区纤维增生,门脉周围硬化产生门脉阻塞。该模型门静脉系统血流动力学改变明显,故非常适用于门静脉高压症的研究。但是不适用于其他类型人类肝纤维化。
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再介绍一种消化道溃疡的动物模型制作方法吧,与大家共同学习!
胃溃疡,以前也是普通外科常见疾病,自从发现HP后,现在基本在消化内科住院治疗了,治疗和预后都很好。
组胺性胃溃疡

所选动物:大鼠

复制方法:禁食24H,于腹部皮下注射磷酸组胺50MG/KG,2H后再重复注射一次,3H后处死动物。打开腹腔,结扎幽门和贲门,胃内注射8ML的1%甲醛溶液;将胃取出浸入甲醛溶液,30MIN后沿胃大弯切开,记录溃疡指数。

模型特点:此法也可以同时诱发食管、十二指肠的溃疡,可以用于溃疡发病机制和治疗药物的研究。
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