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标题:[讨论帖]细胞损伤模型

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-2-9 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如果想做红细胞的体外损伤造模，有什么建议？谢谢
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-2-9 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室有一流的检测设备和很普通的细胞室，惆怅着不知该如何着手细胞的研究，望各位指点！
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loli[使用道具]
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发表于 2012-2-9 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

慢性压迫性神经损伤(chronic constriction nerve injury，CCI)模型

用1％戊巴比妥钠以40 mg／kg的剂量腹腔注射麻醉动物，在左侧大腿中部暴露坐骨神经约1 cm。在三叉上方用4-0号铬制羊肠线每隔1 mm做轻度结扎，共4个结扎点。将肌肉层层缝合，最后缝合皮肤，并注射15万U／只的青霉素。
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发表于 2012-2-9 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

血管内皮细胞（VEC）冷损伤模型的建立
培养4 d的VEC，采用WKL—V型速率冷冻仪冷冻细胞。先以2 ℃/min 的速率从37℃降至4℃并恒温5 min，再 以4℃作为起始温度，在不加任何低温保护剂的情 况下，以1℃/min的冷冻速率分别冻至0℃、一10℃、一20℃ 和一40℃。
其中冷冻至0 ℃的为轻度冷损伤模型、冷冻至一10℃的为中度冷损伤模型和冷冻至一20℃或一40℃的为重度冷损伤模型。对冷冻损伤反应 较为适宜的细胞冷冻模型是中度冷损伤模型或重度中的一20℃冷损伤模型。
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发表于 2012-2-9 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
肾小管细胞氧化性损伤模型
材料：DMEM培养基(Gibco BRL Co生产)， 无糖DMEM培养基(Gibco BRL Co生产)，NRKSIE 鼠。肾小管细胞株(购于华西医科大学内科实验室)，乳 酸钠(国产分析纯试剂)。
方法 肾小管细胞培养 NRKSIE鼠肾小管细胞 用0．25% 胰蛋白酶消化，将小管细胞分离成单个细胞悬液，用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基，于37℃5%(体积分数)CO2 孵箱中培养。每 24 h更换培养液一次，培养2～3 d，待细胞生长成片备用。
实验 将细胞转种于96孑L板，细胞密度 为lO ·mL ，孵育24 h。培养液中加入 H 20 2，浓度为5mmol/L ，作用 30 min。
讨论：
肾小管氧化性损伤在肾脏的缺血一再灌注损伤和中 毒性损伤中起着重要作用。为了从细胞水平阐明活 性氧自由基对。肾小管细胞的作用，本实验用5 mmol/L H2 0 2建立了肾小管氧化性损伤模型。H2 0 2虽 不是自由基，但它属活性氧类，有高反应性，可促进自 由基的生成，引发生物膜的脂质过氧化反应，导致细 胞的坏死和凋亡。一般情况下，生物体内H 20 2常 被酶系统所清除，如过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶。在过氧化氢复制的肾小管氧化性损伤的模型中， 细胞的损伤非常明显，表现为细胞存活率降低，细胞 膜完整性破坏，LDH释放增加，线粒体肿大，溶解明 显增多，数目减少，细胞的脂质过氧化产物MDA含 量增高。利用培养。肾小管细胞复制氧化性损伤模型 避免了全身神经体液、激素水平及局部不同类型细胞间的相互影响，为更深入地从细胞水平研究。肾脏疾患提供了良好的模型。但由于实验所用的肾小管细胞 株，在体外培养的过程，其膜表面结构、细胞器(如线粒体)、酶活性等与原代培养的人肾小管细胞可能存 在一些差异，且该模型不能从血流动力学的角度反 映。肾小管细胞的功能。因此，培养的肾小管细胞氧化 性损伤模型必须与在体模型结合起来，相互补充。
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发表于 2012-2-9 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人想做PC12细胞在过氧化氢的作用下凋亡的试验，我看到上面的帖子说过氧化氢需要买sigma公司的，我不知道这种东西贵不贵，也不知道这种东西买的时候需要买什么样规格的， 所以请各位大侠给点意见！谢谢
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发表于 2012-2-9 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

找到血管内皮损伤大鼠动物模型的制作
1　药品与试剂　盐酸肾上腺素(福州嘉华制药股份有限公司) , 氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司) , 内皮素-1 (ET -1) 浓度试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所)。
2　仪器　HU -12A 透射电镜(***日立电子公司) , FJ-2011 型r免疫计数器(西安国营262 厂)。
3　实验方法
3. 1　动物分组　健康成年SD 大鼠44 只, 雌雄不拘, 体重300±20 g, 由浙江省实验动物中心提供。适应性饲养1 周, 随机分成2 组: 对照组6 只; 血管内皮损伤模型制作组38 只, 其中单纯模型制作组(模型组) 10 只, 另28 只(治疗组) 在模型制作过程中进行高压氧或高压空气干预。
3. 2　模型制作　用生理盐水将1 m g/m l 的盐酸肾上腺素稀释115 倍, 于每天的8: 00、12: 00、16: 00于相同部位皮下注射33.3 Lg (0.05 m l)/100 g, 连续5 天。对照组在同一时间、同一部位注射等量的生理盐水。
3. 3　标本采集　两组动物均于模型制作第6 天晨8: 00, 用氯胺酮按2 m g/100 g (体重) 肌肉注射麻醉, 开胸取降主动脉约1～ 2 mm 3 留作电镜标本, 自心脏取血1.5 m l 测定血浆中ET 21 浓度。
3. 4　电镜观察　SD 大鼠降主动脉标本经3% 戊二醛-1.5% 多聚甲醛固定4 h 以上(4 ℃) , 磷酸缓冲液(PBS) 漂洗后, 1% 锇酸后固定2 h (4 ℃) , 逐级乙醇2丙酮脱水, 环氧树脂618 浸透, 包埋, 超薄切片经枸橼酸铅、醋酸铀双染色各10 m in, 用HU -12A 透射电镜观察降主动脉内皮细胞结构等变化。
3. 5　血浆ET -1 浓度测定　放射免疫分析法。
附电镜图一张


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2012-2-9 17:07
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发表于 2012-2-9 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有
骨骼肌细胞损伤模型的建立
1 　材料　地塞米松磷酸钠注射液(江苏第三制药厂,批号000706) ;RPMI - 1640 培养基(GIBCO ,USA)(每升含10 %小牛血清、L-谷氨酰胺0. 33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7. 4) ; 胰蛋白酶(Difco ,Lot :12885655) ; 四甲基氮唑盐(MTT) ( FLUKA , Switzerland) ;FLUO-3/ AM(CALBIOCHEM,Ca) ; 二甲基亚砜(DMSO) (MERCK,USA) ; SOD 与MDA 试剂盒(南京建成生物工程研究所) ;吖啶橙(AO) 、溴乙啶( EB )(FLUKA ,Switzerland) ;酶标仪(BIO-RAD ,USA) ;荧光显微镜(OLYPUS ,Japan) ; 激光共聚焦显微镜(BIO-RAD 公司MRC-1024 型,USA) 。SD 大鼠(南京中医药大学,动物合格证号:SCXK(苏) 2002-0012) 。
2 　骨骼肌细胞原代培养　取出生1d 的SD 大鼠四肢肌肉,切碎后用37 ℃的消化液(0. 05 %胶原酶和0. 25 %的胰蛋白酶) 消化两次,每次15min。经Percoll 密度梯度离心后,收集细胞,用Hank′s 液洗两次,199 细胞培养液(10 %胎牛血清) 悬浮细胞,接种入细胞培养皿。37 ℃培养12h 后收集未贴壁细胞并计数,种入细胞培养板,37 ℃培养 。待细胞生长并融合进行如下实验。
3 　细胞增殖测定(MTT 比色) 　设地塞米松大(5mmol/L) 、中(1mmol/L) 、小(0. 2mmol/L) 剂量组,于加药培养后的第24h 从96 孔培养板中吸取100μl 培养上清液,每孔加入25μl 浓度为5mg/mlMTT溶液后,继续培养4h ,吸去旧培养液,再向各孔加入100μl 的二甲基亚砜(DMSO) 100μl ,振荡5min ,等细胞代谢MTT后所形成Formosan 充分溶解后,用酶联免疫检测仪测定490nm 处的吸收度值。
4 　SOD MDA 测定　于加药培养后的第24h 从96孔培养板中吸取的100μl 培养上清液,按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明进行测定。
5 　形态学方法　将骨骼肌细胞接种于处理过的载玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h 后,分别收集上清细胞及贴壁细胞,加吖啶橙和溴乙锭(AO/E 染液,在荧光显微镜下观察活细胞(VN) ,核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞(VA) ,核染色质着绿色呈固缩状或碎裂状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,核染色质着橘红色呈固缩状或碎裂状;坏死细胞(NVN) ,核染色质着橘红色并呈正常结构。并计算损伤率:
损伤率= [ (VA + NVA + NVN) / 总细胞数] ×100 %。
6 　钙离子动态变化的测定　用敏感性钙指示剂FLUO-3/ AM,结合激光共聚焦显微镜(Laser ScanningConfocal Microscopy ,LSCM) 检测技术,分析细胞内钙离子的动态变化 。储备的FLUO-3/ AM用D-Hanks液稀释至5μmol/L ,取10μl 加于培养的骨骼肌样品上,置5 %CO2 孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks 液洗1 次,再用激光扫描共聚焦显微镜观察FLUO-3/ AM染色的骨骼肌某一层面的萤光图像。取地塞米松10μl 轻轻加入孔中,使终浓度达到1mmol/L,迅速以间隔4s 的速度扫描,计算机记录储存扫描结果, 使用软件为Time Course ( Kinetic ImagingSoftware for MRC-1024 and MRC-1024UV Confocal Imaging Systems) 及Lasersharp 数据处理软件。
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 小中大

由于最近要开始做瘢痕组织中 成纤维细胞培养
所以整理了一些 其 培养方法
as follows：
瘢痕组织中成纤维细胞培养
方案1
1．细胞培养材料：取病人手术切下的病理性瘢痕组织及其周围正常组织。
2.取材部位：前胸、四肢等，病人年龄从3到35岁，瘢痕生长时间为6个月到1.5年。
3.采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。
4．过程：在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5-1mm3的小块，加入少量小牛血清，接种于培养瓶中，在95%空气,5%CO2, 37°C, 饱和湿度条件下培养24小时，使组织块牢固贴附于瓶壁。 然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，每周两次换液。
约3-4周，原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1：2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次，待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3-10代细胞。

方案2
1. 1 　材料　瘢痕组织:医院整形或烧伤科或烧伤科提供。DMEM 培养液(美国Gibco 公司产) ;小牛血清
1. 2 　方法　手术切取病人的瘢痕组织,在无菌条件下立即置入DMEM 培养液(含10 %FCS、青霉素100 U/ ml ,链霉素100μg/ ml) 的培养瓶中,于4 h 内在净化工作台内取出标本,放入加有青- 链霉素的DMEM 基础培养液中清洗2 次,尽量去除血污及表皮与基底层,将清洗干净的瘢痕组织用眼科剪剪成0. 5～1 mm3 的小块,分别转入2 支试管内,然后分步消化培养: ①单细胞培养法:将试管内组织用Hanks’液洗2 次,吸出上清,加入5 ml 0. 25 %胰蛋白酶液,置37 ℃消化20～30 min (或加入5ml 0. 1 %胰蛋白酶液,置4 ℃冷消化过夜) ,加入2 ml 小牛血清终止消化,去上清液,加入10 ml DMEM 完全培养液,用吸管将组织吹打成单个细胞悬液,200 目不锈钢筛过滤,离心去上清,Hanks’液洗2 次,加入DMEM 完全培养液,将细胞充分打匀,以5 ×105 细胞接种于50 ml 培养瓶内,置37 ℃、含5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中培养,2～3 d 更换一次培养液; ②组织块贴壁培养法:分胰蛋白酶消化组及未消化组,消化组用0. 15 %胰蛋白酶液将组织块消化5～10 min ,去消化液, Hanks’液洗2次,去上清,加入含20 %FCS 的完全DMEM 培养液4～6 ml (视组织块量多少而定) ,混匀,静置数分钟,弃上清,然后用弯头吸管将消化或未消化的组织块移入用FCS 湿润过的培养瓶底部,均匀散在贴壁,滴加少量的完全培养液,置37 ℃、含5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中培养,3 d 以后再补救加2 ml 完全培养液,此后3～4 d 更换一次培养液,待纤维细胞长满瓶底时作传代培养。
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 小中大

求助：我现在做心肌细胞培养，制造心肌细胞凋亡模型，想用过氧化氢，但不知道浓度和作用时间，还有买哪家公司的过氧化氢？各位战友请帮忙啊!谢谢！
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