细胞世界

我目前也在养MEF 但失败次数多于成功
个人总结如下：
1 我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点
2 我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了
3 我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱
4 原代培养的最大天敌还是污染 前几次养了 满盘都是细菌 同学都笑话我时不时巴斯德研究所的。

期待大伙做原代培养的酸甜苦乐。。。

good luck and have fun

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你说的这种方法还挺新颖的（只取皮肤），我就是按照传统的大家都用的那种去头去四肢、内脏的方法，消化也是热消化，加上胰酶，并且配合吹打，消化上两三次，直接接种完事。比较简单，消化时间也容易掌握。只不过问题是这样养出来的细胞杂细胞很多。
感觉你用的老鼠天数挺大的，是不是因为你要用皮肤的原因呀。我一般用13天左右的。15天左右时分离出来的组织上有好多血丝，除不去，可能因为小鼠那时血液循环系统已经逐渐发育有关。
总体感觉MEF好养活，不好养好！

我感觉MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
成纤维细胞尽管都能养活，但是养得好才叫本事，也只有养得好才能保证实验出好的结果，反正我感觉用MEF养胚胎干细胞是这样。

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你的回复很有用，我老把当成胚胎干细胞来养，生怕养不好，所以用的是hyclone的血清，确实比较贵。还有我也很想看到大家讨论一下MEF转染的问题，就象楼上朋友所提出的问题，大家可以仁者见仁，因为就我感觉，用病毒转染肯定效率比较高些，我以后可能会尝试一下，但是需要优化各种条件。因为毕竟现在还有好多实验室达不到这种做病毒转染的条件，如果能够用电转或者lipo2000来优化，从而达到非常好的转染效率，那就非常好了。请有经验的群友介绍一下自己的心得，分享是一种美德！

成纤维细胞尽管都能养活，但是养得好才叫本事，也只有养得好才能保证实验出好的结果，反正我感觉用MEF养胚胎干细胞是这样。

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的确说的好。我也在养，成纤维细胞还是比较好样，对血清，培养基要求不高。国产的血清，如天津TBD就养的挺好的，但要把细胞养活力好，状态好，不老化，才能满足做饲养层的需要。还是要勤观察，勤换液，勤传代。

我目前也在养MEF 但失败次数多于成功
个人总结如下：
1 我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点
2 我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了
3 我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱
4 原代培养的最大天敌还是污染 前几次养了 满盘都是细菌 同学都笑话我时不时巴斯德研究所的。

期待大伙做原代培养的酸甜苦乐。。。

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直接取皮肤消化得到的胚胎成纤维细胞是不是会更纯一些，你是参考哪个实验室的protocol啊？

直接取皮肤消化得到的胚胎成纤维细胞是不是会更纯一些，你是参考哪个实验室的protocol啊？

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可能会纯一些 而且我经过滤网过滤
很惭愧这个是我师姐想出来的法子 呵呵不知道是不是原创
不过按照一贯的做法也可以啊 杂细胞经过两三次传代应该可以清除掉
毕竟成纤维细胞是优势细胞

我用的是qiagen 的hieffect 转染试剂,效率为siRNA50%,plasmid 15%,正常吗?有没有人有更高的转染方法或试剂,最好是用转染试剂.

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我就用lipo2000,转染plasmid,plasmid和lipo2000都只用protocol剂量的一半,转染效率就能够达到40%以上.
(1)我不知道你用的质粒是用什么方法提出来的，我用的是endofree maxi qiagen试剂盒，提出来的质粒质量很高，如果是用小提试剂盒或者大提碱裂解法提出来的 质粒，效率就会很低，不会超过20％。
（2）这个转染试剂我们实验室曾经又人用过，包括罗氏fugene转染试剂也用过，单效果都没有想象的好，应该是操作问题，单感觉lipo2000很不错，就是毒性大点，感觉做瞬时转染不够好，但转染试剂琳琅满目，看广告不如看转效，不晓得哪个最好，希望能又用的比较好的战友推荐一下
（3）这个转染试剂也挺贵，我记得是24孔板可用166次（500ul），3000多吧，是这种吗 ？
（4）不知道有没有人用过qiagen的RNAifect转染试剂，cat.no301605，怎么样啊 ？有没有更好的？