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标题:[求助]共聚焦显微镜的详细~~制片方法！

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发表于 2012-2-10 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]共聚焦显微镜的详细~~制片方法！



我要用共聚焦显微镜测活细胞（卵母细胞）内钙离子浓度的变化，不知道应该如何制片，请各位高人指点！感激不尽~~~！！！
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HPLC使者[使用道具]
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发表于 2012-2-10 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我取的卵母细胞是悬浮的，而且数量上不可能达到文献上说的10的几次方每毫升，应该怎么处理啊？
再做共聚焦之前要让细胞贴壁吗？怎么才能让细胞贴壁呢？
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发表于 2012-2-10 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养卵母细胞是用96孔板吗？
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发表于 2012-2-10 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你既然要测活细胞的钙离子浓度变化,就不能制片啊!你那卵母细胞是贴壁细胞么!如果是的话可以在孔板里(选几孔的就看你做几个样了)放置盖玻片,将细胞种在玻片上,让其贴壁然后用钙探针孵育后上机检测!不过有的激光共聚焦仪器上有装细胞的小槽,我去做的那个就有!不过我们没用到那个槽,你可以问下做激光共聚的老师,询问下意见!
以前我也做过贴壁细胞的钙离子浓度变化,是向细胞中加入终浓度为4x10-3g/L （4mg/L）的Fluo-3/AM钙探针，孵育30min.上机检测10Min就行了,看你的实验是需要要测定好久.
如果是悬浮的细胞,好象共聚焦不能定位吧!移动的细胞怎么测定!
至于细胞数目,做激光共聚焦对细胞要求好低哦,测定某个参数只需有少量正常的细胞即可,定位单个细胞起来方便,细胞多了反而不能定位.
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发表于 2012-2-10 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

孔板的问题是镜头从低倍切换到高倍时镜头会撞到孔板上，或出现几个镜头靠的太近，而扫描时所要用聚焦的镜头伸不进孔板。
你可以使用小培养皿培养细胞
如果做测试钙离子浓度变化,可以先简单的用KCL来刺激钙离子的释放，
染料可以考虑用Fluo-3/AM和Fruo-2，Fruo-2比较贵
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-2-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看看这种培养皿吧，就是针对这种问题的。实际上底部就是一个很薄的盖玻片，可以在倒置显微镜上直接观察。我们原来用的就是这个，不过当时是从别处要来的，没有自己订货。

该公司的网址是：cuturl('http://www.glass-bottom-dishes.com')，我们当时使用的型号是：P35GC-1.5-14-C（推荐）。还有一种是不知道型号，底部玻璃片是圆形的，带有网格（类似于细胞计数板），可以随时定位每个细胞。

花絮：自己用502将盖玻片贴到六孔板底部，细胞全死翘翘了。后来打听到关键是要有那种无毒的胶水，据说某个老师从国外带回来有，不过我一直没有买到。


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发表于 2012-2-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的卵母细胞是给小鼠打促排卵药物后取出来的，数量不多，是悬浮的，没有办法贴壁，那应该怎么办啊~~~~~~~
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发表于 2012-2-10 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有人告诉我说，将细胞染色好的悬液滴在很薄的载玻片上，然后加盖玻片，翻过来就可以上机检测了，这样可以吗？？？
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发表于 2012-2-10 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般共聚焦显微镜中配置的物镜是为载玻片和底部有盖玻片的培养皿设计的，由于物镜焦深短，所以只能观察贴壁细胞。

鉴于你现在的实验，建议你采用长工作距离的物镜观察悬浮细胞。但是使用长工作距离物镜完成你的实验也有一些困难。
1、贴壁的细胞你可以先找到细胞，再上钙探针孵育，然后直接观察；悬浮的细胞先上探针孵育，再找细胞观察，因为你加探针时细胞就漂走了。

2、如果你只是检验是否有钙离子释放，钙离子浓度变化，以上方法还可行；如果你是定量分析钙离子释放速度的话，以上方法不可取，考虑其他固定细胞的方法吧。
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发表于 2012-2-10 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你既然要测活细胞的钙离子浓度变化,就不能制片啊!你那卵母细胞是贴壁细胞么!如果是的话可以在孔板里(选几孔的就看你做几个样了)放置盖玻片,将细胞种在玻片上,让其贴壁然后用钙探针孵育后上机检测!不过有的激光共聚焦仪器上有装细胞的小槽,我去做的那个就有!不过我们没用到那个槽,你可以问下做激光共聚的老师,询问下意见!
以前我也做过贴壁细胞的钙离子浓度变化,是向细胞中加入终浓度为4x10-3g/L （4mg/L）的Fluo-3/AM钙探针，孵育30min.上机检测10Min就行了,看你的实验是需要要测定好久.
如果是悬浮的细胞,好象共聚焦不能定位吧!移动的细胞怎么测定!
至于细胞数目,做激光共聚焦对细胞要求好低哦,测定某个参数只需有少量正常的细胞即可,定位单个细胞起来方便,细胞多了反而不能定位.

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请问我做贴壁细胞，想观察加药前后细胞内钙离子浓度的变化，大概药物作用24小时后吧，要观察的必须是同一个细胞或者是同一个视野吗？应该怎么做啊？恳请指导，谢谢
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