细胞世界

（1）测定ROS完全可以不用试剂盒。直接从sigma购买DCFDA后回来溶解就行。

（2）你即使使用试剂盒，特别是中国的试剂盒，也需要进行条件摸索。我的经验是DCFDA的浓度要加到50uM才有荧光。你的浓度可能太低了。

（3）我测定ROS时根本没有用什么ROS up，测得也很好。

（4）你的DCFDA使用什么溶解的？我一般用无血清的培养基。

（5）加DCFDA之后需要避光孵育。

（6）你的药物刺激时间也需要摸索，因此在初次实验时需要设置阳性对照。

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谢谢你的关注！
1，使用试剂盒只是因为直接从sigma购买，量太多我用不了，价钱也贵~试剂盒里东西都是一样的；
2，可能是我DCFH-DA用量不够。期间我还用过24孔板，加DCFH-DA的量为10uM的300ul，但是空白和阳性对照同样有荧光，而且都很强。
3，我那个Rosup其实就是做阳性对照的，装载探针后加Rosup，激发细胞内活性氧的增加，不是什么添加剂；
4，我用pbs稀释的，不知道这两种操作有无差别~
5，避光的话需要到什么程度？拿铝箔把整个96孔板都遮住吗？

附图为我24孔板的阳性对照，即加了rosup刺激产生活性氧的细胞荧光。
后一个是空白，即只加入了DCFH-DA作为空白对照的，没调好焦距，不过可以看出荧光也很强

（1）我觉得你的检测不能只通过眼睛观察荧光的强度。你必须要用荧光仪测定荧光吸收强度，做量化检测。

（2）另外，如果你的细胞是可以消化的话，最好采用流式检测，结果是最准确的。

（3）荧光照片只能作为support evidence。并不重要。

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明白了~看来还有好多要做的涅~麻烦...
ps：我们是化学实验室，木有流式...