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标题:[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

newway[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做过alamar blue ，MTT，台盼蓝，感觉上，台盼蓝可以分辨出死细胞，但是计数不如其他两种精确；MTT反应产物停留在细胞内，必须破坏细胞膜才能检测，可以用DMSO＋SDS＋HCL或醋酸 配置破膜溶液，效果一直很好，但是由于细胞死亡，无法进行后续检测，最多只能同时测培养基里面的物质如ALP等，所以要求很多样品数才能做完其他检测方法，还有一点就是，MTT的反应产物总是同时存在于细胞内和培养基中，这对实验结果有一定影响，造成MTT的可重复性不佳。alamar blue，则对样品数要求相对少，因为alamar blue 的产物resorufin是可溶的，可以检测培养基里面的resorufin而不必破坏细胞，但是由于resorufin是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，对培养的时间要求也相对MTT来说要苛刻，还有一点就是alamar blue的花费也较高。
以上是个人经验，大家参考
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baidukk[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前用MTT，结果重现性差，还不如用细胞计数来的准。用过CCK－8后好多了，方法简单，只要加一次试剂就行了，而且重现性也好，不过细胞不能太密，否则会颜色太深而超过线性范围。
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04906[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我以前曾参与研究开发一种天然来源的免疫抑制剂。该物质被证明主要是由多肽类物质组成。我们以3H-TdR参入法测定免疫抑制剂对PHA诱导的人外周血淋巴细胞（PBL）转化的影响，组分活性以对PHA诱导的人PBL转化的抑制率表示。

具体步骤是：

将待测样品用RPMI-1640培养液稀释成一定浓度。以无菌手续采集3人份静脉血，每1ml加10u的肝素钠抗凝。取24孔培养板，向每孔内加人外周血0.1ml，对于每个人的血样做3个重复孔。向每孔内加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液1ml、PHA应用液0.1ml。试验孔加样品液0.1ml，对照孔加RPMI-1640培养液0.1ml，加盖后在CO2培养箱中于5% CO2、37C条件下培养48h，加入浓度为3.7×105Bq/ml (10uCi/ml)的3H-TdR 0.1ml，混匀后继续培养24h，用49#玻璃纤维膜收集淋巴细胞，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）。将每个人3个重复试验孔cpm的平均值作为试验样品作用于该人血样后的cpm值，按下式分别计算样品对PHA诱导的每个人PBL转化的抑制率：
抑制率（%）=（1－实验组cpm/对照组cpm）×100%
以3个人血样抑制率的平均值作为样品的活性。

该试验重现性很好，结果也较为可靠。
但是个人感受是“都快怕了”做这个试验了。
首先是放射性，莫名。
然后是细胞试验本身（细胞是人源原代，本人当然首当其冲是第一个志愿者，呵呵；原代培养本身也有点），当然，这与该测定细胞活力方法本身无关。
其次是时间较长。
还有在自己单位不能独立完成，需要很多特殊设备。
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对细胞增殖实验来说，MTT、CCK-8和3H-TdR 我都做过。感觉是前者便宜、步骤烦琐、对实验技能要求大，否则误差较大、敏感度在三者中最低。CCK-8稍贵一点、步骤简单、稳定性不错、敏感度介于两者之间。3H-TdR 敏感性最好、但步骤较多、需要特殊设备，最大的问题是有放射线。 所以综合评价，我们觉得CCK-8简单、稳定、敏感性好、安全、价钱还能接受，所以现在细胞增殖实验主要用CCK-8来做，敏感性要求特别高的就用3H-TdR （没有小孩的、女性的一般还是避免用3H-TdR ），而MTT主要用来做学生实验。

希望对大家有用！
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问个问题

做CCK-8的时候，

要先把原来的培养基去掉，

再加CCK-8吗？
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不需要的。可以直接加入cck-8 1-4个小时左右，可以检测
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toy[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问个问题

做CCK-8的时候，

要先把原来的培养基去掉，

再加CCK-8吗？

============================================================================================

一般不需要！如果你要求高，可以去掉培养基后，用PBS稀释CCK-8后，每孔100ul加进去，培养30分钟后上机检测。
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langlang[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的实验用过台盼蓝染色、MTT、CCK-8．我分离的是病人的淋巴细胞，经不同浓度的药物处理后，检测细胞增殖变化，台盼兰染色可以发现药物抑制细胞增殖是因为药物作用还是浓度大引起的毒性反应．可以发现较大的浓度药物经台盼兰染色后活细胞比例低．大部分文献对淋巴细胞增殖测定方法，用的是3H-TdR．我们实验室的这种仪器坏了，我查阅做淋巴细胞也有人用过ＭＴＴ法，所以一开始我用ＭＴＴ算是一个预实验，测定细胞增殖能力如下：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔， ％CO2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。但是结果不理想，可能淋巴细胞为悬浮生长，ＭＴＴ中间环节多，容易吸出细胞，结果不稳定．后来看过ＣＣＫ－８的资料，就试着用用，跟ＭＴＴ相比，步骤简单，省时省力，缺点当然是比ＭＴＴ贵多了．每次的结果稍有不同，统计学还是有意义的，主要经验体会是：细胞量要够大．至少每孔保证１０５的量，其次要充分混匀，最好在摇床上摇荡几分钟．孵育时间要摸索，淋巴细胞在４８小时的结果最好．
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了 前面的帖子，我觉得很多人都在谈增殖的检测，将增殖和活性的检测混淆了。其实MTT是活性的检测，我前些天做了MTT，虽然结果还好，但每次之间的波动还是比较大，因此希望用更精确的流式检测来证实。但是很少人提起PI染色进行流式检测还检测细胞活性，希望有这方法经验的能够提供详细的步骤，和所需物品及PI配置方法。
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idea2011[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
XTT法
XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide}是MTT的一种衍生物,可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的Formazan产物而显色,显色程度与活细胞数成正相关.主要有点是反应产物为水溶性,对贴壁和悬浮生长的细胞均适用,检测时间缩短和处理步骤减少,但本底较高,重复性受pH的影响,其它与MTT法相同
此外还有MTS法
MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]为新一代四氮唑蓝盐化合物,其被还原形成的Formazan产物水溶性和稳定性更高,显色更快

参考<抗肿瘤药物研究与开发> 甄永苏 主编
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