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标题:[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

ffooll[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实直接计数法也是一种非常好的方法，至少比MTT来得准确。
首先在10cm的Dish中接种1000-10000个细胞，然后培养1周至2周，消化后，进行计数。此法简单易操作，也非常公认，主要是依靠时间来放大不同处理组的差异，原理与clone formation assay 差不多。
此外，BrdU掺入法也是不错的检测细胞增殖的好方法，原理3H放射性同位素掺入法一样，但可以不接触同位素，用荧光显微镜或FACS即可检测。
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jujuba[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入CCK-8，再培养数小时后，还要终止 显色反应 吗？

有的方法是放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止，哪种好 ？

还有为什么要终止，不终止直接测结果不行吗？
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idea2011[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

台盼兰染色的方法很简单，首先配置台盼兰染液，通常用的浓度是0.4％的，可以先用双蒸水配成4％的，然后用的时候用PBS稀释成0.4％。细胞培养到一定时间，按照一比一的比例加入台盼兰染液，我做悬浮细胞通常是100ul含细胞培养液，加100ul台盼兰，也可以吸10ul细胞液加10ul台盼兰，但要注意，吸细胞的时候一定要混匀，如果只吸上面的就会导致细胞过少。通常染色2分钟，到血细胞计数板上计数即可，看染色和没有染色的。
个人觉得，台盼兰染色法是一个很不准确的实验，像我做的药对细胞有杀伤作用，但是细胞数量少了，却很少看到有被染色的细胞。另外，显微镜下是否被染色也是不太容易看出来的，有的细胞看上去是染成蓝色的了，但是调一下焦距又变成亮亮的和正常细胞一个样子了。还希望有经验的XDJM指点一下。我还曾经遇到，台盼兰染液是澄清的，计数板是干净的，但是染色后的细胞液滴到计数板，镜下看却又很多蓝色碎片一样，视野十分浑浊，不知是什么原因，而且实验组和对照组这种浑浊并没有很大区别，不知道是怎么回事，请指点一二，谢谢!
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发表于 2012-2-13 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入CCK-8，再培养数小时后，还要终止 显色反应 吗？

有的方法是放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止，哪种好 ？

还有为什么要终止，不终止直接测结果不行吗？
回答：一，不需要中止反应
二，您提要的“放到4度冰箱终止，有的是加SDS终止“这种是针对，如果有急事要去处理不得不放下手中的实验，而提供的方法，一般没有必要不需要使用，如果要使用不建议使用加SDS终止这种方法！！
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misswu61[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
H3掺入试验、MTT比色法、XTT比色法都属于测定淋巴细胞体外增殖反应的方法吧。我最近也要做关于这方面的实验，就把师兄介绍的测细胞增殖反应时应注意的问题说一下吧：
（1）丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。因此在实验前，应确定其最佳刺激量。
（2）检测T细胞增殖反应，丝裂原用PHA或ConA；B细胞增殖反应用LPS或SPA；T、B细胞增殖反应用PWM
（3）增殖反应的细胞应保持高活性，一般应〉=95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂（如NaN3）或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
（4）细胞培养液应无菌、无支原体污染，特别是小牛血清加热灭活补体，避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此，实验前应选择本底低的小牛血清。用人“AB“型血清或自体血清也应加热灭火补体。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自我感觉比起传统的MTT法，新试剂确实操作简单，灵敏度高。
经过繁琐忙乱的一段时间的试验操作之后,回过头来再看看基础
知识和文献有种豁然开朗的感觉.原来如此.原本如此.
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8princess8[使用道具]
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 小中大

做细胞毒性加药设计和操作一直觉得是个可大可小的问题 ，估计结果重复性差可能有这方面的原因，总结一点自己的惯用手法：
1。首先用培养基将细胞毒性药物(待测药物)5倍 系列稀释,共制备8个浓度.选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死,而最低浓度下不会杀死细胞为标准.只要对药物的毒性有所了解,便可采用较小的浓度范围.一般情况下,我每种药物使用三块培养板,这样一次试验中可以有三个平行测定结果.
2.对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列个孔中的培养基,这样可以通过将注射器针连在吸引管上来完成.
3.在第2列和第11列共8个孔中,加入200ul新鲜配置的培养基,这些细胞作为对照.
4.在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物.每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D 用于一种药物,E-H用于另一种药物.
5.将药物溶液向每组的4个孔中各加入200ul
6.温育
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loli[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家用的是哪个公司的CCK-8试剂盒呀
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MTT法测定样品的生物活性, 我也曾经做过不少实验

前期的细胞铺板,样品处理都是很常规的实验室操作.

染色阶段: 我们一般是 将MTT用细胞培养液(1640或DMEM)稀释成5%的溶液, 过滤除菌, 于96孔板中加入10-20ul/孔, 再于孵箱中放置4-6hr.

溶解: 可以使用10%SDS或者DMSO.

10%SDS可以直接加入96孔板50-100ul/孔(依据不同实验来确定),再在孵箱中放置过夜, 并于酶标仪上在一定波长(570nm左右)下读数. 该96孔板在随后的2-3天内的读数不会有太大的变化.

使用DMSO时, 一般需要将96孔板中的上清夜除去, 然后加入100-200ul/孔的DMSO. 静置20-30mins, 于酶标仪上在一定波长(570nm左右)下读数.
DMSO的优点是: 仅仅需要30分钟就可以读取数据, 实验时间大大缩短.
DMSO的缺点是: 加入DMSO时,先要除去96孔板内的上清夜, 可能会造成细胞的损失,给实验 结果带来不必要的误差.

以上是本人的愚见.
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 小中大

为什么没有人提到酸性磷酸酶（Acid phosphotase assay）法呢？
我们和旁边的实验室一直在用，干净又方便。
原理是这样的：
将一种底物（硝基苯磷酸盐）与细胞一起孵育（就是加到96孔板的孔里），细胞溶酶体里面的酸性磷酸酶将底物水解生成另外一种可以显色的物质，用酶标仪在405nm处测量就可以。显色程度反映了细胞里酸性磷酸酶的活性，进而反映了细胞的活力。
这个方法大约十年前外国人发现的，同H3掺入以及MTT也作了比较，提示完全可以代替。而且非常干净。而且很便宜，只需要买底物就可以（5g大约400元 Fluka）。
原始文献下一次附给大家。
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