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标题:[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

vera+[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我没有用过MTT法，使用的是WST－1法。理论上，WST－1法显色原理与MTT法相似，但是WST－1是水溶性的，MTT是脂溶性的，因此WST－1法比MTT法处理过程要简便，受影响因素少，只需将种好板的细胞的培养基从孔板中弃去，然后加上200微升PBS和20微升WST－1溶液（自己配制的,用PMS和WST－1按一定比例加PBS涡旋混合后，在－4摄氏度保存，避光。），同时加上空白对照。置二氧化碳孵箱中约3小时后，直接在酶标仪下测定OD值，450nm/650（690）nm，然后将值减去空白对照后，对比差值即可。
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hold住[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家用的是哪个公司的CCK-8试剂盒呀

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我用的是同仁化学研究所的
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mtt法以上说得已经很多了，但是细胞密度是在10的4次方是最合适的，当然这只是量的检测，最近我做的是用细胞活力测定仪来测可以得到绝对值，可以同时打出100张图片，死细胞和活细胞可以看见，我觉得很好，在还有用激光共聚焦测，比较准确，但花费很贵，要求较高，它比mtt及台盼兰好的多，台盼兰可以杀死部分活细胞而影响结果，我下次将要用激光共聚焦测，但分析软件比较贵。
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8964357[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

近期我做过一些MTT，总的感觉不稳定，同组间OD值相差较大。考虑可能与弃掉培养基再加DMSO这一步有关。我用的贴壁细胞，做药物抑制实验。以前听人讲，贴壁细胞去除培养基直接翻板倒液就行。我在镜下观察发现倒板后会倒掉一些着色细胞。以前在园子里有人提过，MTT也可抑制细胞活性，使其贴壁不牢。后来我采用96孔板离心后直接倒掉培养基或小心吸弃培养基，实验结果较前理想些。
今看过楼上多位老师提到CCK-8试剂盒，我想试试。谁能否提供操作步骤、哪家试剂公司的好些，价格多少？多谢了！
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发表于 2012-2-13 13:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MTT法作了很多细胞，感觉对于贴壁细胞效果好，对于悬浮细胞，因要吸弃培养液，很容易造成formazan流失，因而导致实验结果偏差。SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。除此之外SRB法还有以下优点：　(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。因此选用SRB法对于测定不易贴壁的PC12细胞存活率，结果更灵敏准确，重复性更好。
建议大家可以试一下SRB法，SRB价格也便宜。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也在做MTT，确实很不稳定，组间差异就很大。前面大家已经说了很多了，我觉得还应注意的是：
1，培养基中酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白、小牛血清、胎牛血清或马血清和某些添加剂可使OD值增高，影响结果。因此这类物质在进行MTT时应先洗去。
2，加入DMSO后应及时检测，OD值受作用时间的影响较大，颜色会随时间变深。
3，接种细胞数要合适。在应用一种新细胞株时，首先要知道该细胞株的细胞倍增时间，而在应用非分裂的原代细胞（如神经元或肝细胞培养）时，首先要知道该细胞在培养过程中细胞丢失的数量。根据这些信息选择合适的接种细胞数量。在MTT法进行时，96孔板中每孔的细胞数量宜控制在5*10的2次~5*10的4次范围。
4，每孔内各区的细胞生长不均匀可直接影响实验结果。当加药液或换营养液时，药液或营养液沿孔边缓慢加入，但不能直接加在细胞上。细胞培养的每一步操作时尽量避免产生细胞生长不均匀的各种因素。
呵呵，希望能对大家有帮助！
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前面有位前辈提到PI染色检测细胞活性，我也是做细胞培养测药物作用后细胞活性的，前一段时间在网上查到一点PI方面的资料，希望有帮助。
流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst 33342/PI双染色法
来源：生命经纬
基本原理
　　经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

试剂与仪器
 Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；
 PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。
 400目的筛网
 流式细胞仪

实验步骤
1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。
3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4. 400目的筛网过滤1次。
5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6. 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项
1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
2. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。
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 小中大

我用过MTT、台盼兰拒染法，也试用过CCk。MTT方便快捷，但影响因素较多，用来做筛选还是不错的。台盼兰拒染法，我认为不太客观，最好是双盲。CCk方便、准确，悬浮细胞也可以用，我想除了有点贵没有别的缺点了。还是根据各自的情况选择合适的方法吧。
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 小中大
大家有没有试过ATP检测，实际上ATP的含量也是可以对细胞的活力进行表示的。死亡的细胞是没有ATP的，有损伤，但还没有死亡的细胞其ATP含量是下降的。因此，用ATP是完全可以代表细胞活力的，并且用荧光素酶法检测试验比较稳定，而且可重复性好，比MTT稳定多了，我最近刚刚作了一次。大家可以探讨一下这一方面的体会
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any333[使用道具]
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 小中大
ATP含量测定，目前已经被大家接受为一种细胞活力检测指标，国外的相关文献已经有不少，我也是从文献知道的。目前国外已经有几家公司专门卖这中试剂盒了，国内也有，好象是壁云天公司。其原理是荧光素酶与荧光素反应时需要ATP，当用饱和浓度的荧光素酶和荧光素反应是，其发光量于ATP之间是存在定量关系的，具体来讲是它们的LOG值呈线性相关，这样就可以通过荧光值得到ATP　的含量了。一般来讲，样品中的ATP量是不大的，因此一般情况下是不需要荧光素酶的饱和剂量，这样太浪费试剂，但个别情况下ATP含量奇高，就需要这样作了。我做过几次，实验的可重复性明显好于MTT。在作MTT时由于它的变异度较大，不得不加大样本量，但ATP含量测定其稳定性较好，样本量一般不需要很大，我一般每一个分组有四，五个样品足够了。
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