[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论 - 经验共享

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标题:[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

TNT[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过MTT对海洋动物细胞的活性监测：
MTT法优点是简便，设备要求不高，检测样品量要求不高；
孵育至少4~6小时，好像并不快；
如果培养液中有庆大霉素，加MTT，庆大霉素浓度大于标准两倍就会出白色沉淀，有一年元旦加班就是这个原因，通宵白忙；
检测波长一定要慎重选择，扣除本底的影响，不是文献上的都能用；
标准曲线有上限，超过上限就会不呈线性，虽然是大多数人都知道，可是实际应用常常忘掉；

TNT[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

"总感觉MTT法存在太多的误差。可能是因为我还没掌握要领吧。"
——这也不一定，小心注意每个容易出错的环节，注意标准化和连续性，结果才能稳定；

首先有一个问题想请教一下：
对于不同的细胞是不是都要做一个细胞数和OD值的线性曲线，具体实验方法，哪位有文献可以上传吗？
——是要做的，不同的细胞差别很大；就是将一定浓度细胞（以后检测细胞浓度也在范围内），做检测，看是否符合线性；

加完MTT，4小时后需将MTT吸走，再加入DMSO，该步骤极易将形成的结晶吸走，有没有好的办法，我只能用MTT。
——需离心！

想研究病毒、药物的协同作用，大家在实验设计上是否有好的办法。做了几个月实验，感觉没什么收获。狂郁闷·
——正交设计，均匀设计都可以；

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做了几次MTT，结果都很不好，看到大家的帖子真是信心大增。
想尝试用一下CCK-8.
请问CCK-8在哪能买到呢，如何稀释!!

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的实验体会：
1。台盼蓝染色法，对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
2.克隆（集落）形成法，对贴壁细胞来说，较为方便，也较客观。但要注意（1）一定要将细胞充分分散，边摇边加入孔板中；（2）用枪加到孔板时，用力柔和，避免细胞冲到孔板的壁而沉下，导致细胞克隆在孔板的四周较多，中间较少，细胞克隆集中于四周，导致计数误差。
3.MTT法，测定的是细胞浓度，要注意细胞悬液的体积。血清蛋白对实验测定有干扰，要弃上清，加入一定量的SDS或DMSO溶解沉淀物，这两步都会给实验带来误差。而且在96孔上操作，实验孔较多时，加样次数越少越好。所以，该法如斑竹所说，会有误差。
4.CCK－8的实验，只加样一次，实验比MTT法简单，比台盼蓝染色法客观，它的缺点有两方面：（1）比较贵；（2）加入CCK8试剂后，一般要放入CO2箱1-2.5小时，保温时间越长，测定A值越高，虽然每一孔的A值都增加了，但不同的孵育时间，测定的IC50还是不同的，但IC50改变不大。本来细胞浓度测定，测定的细胞浓度是相对值，无论台盼蓝染色法，MTT法，CCK8法都是相对准确的实验，在此意义上，CCK8可以说是比较方便，准确，客观的方法。我们小组的经验是（1）酚红的颜色可能影响实验结果（都是橙黄色），若实验的试剂空白组A大于0.2，则实验体系用无酚红的1640（有售），否则，则不怕/忽略酚红的影响。（2）每次实验，不同孵育时间，A值不一样，以“细胞对照组A＝1.0左右”为最佳孵育时间，每次实验与此统一。

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提问：
谁能提供关于mtt实验前测定细胞贴壁率、倍增时间和不同细胞数条件下的生长曲线的方法？？谢谢！

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了一圈，有人提到了我想提的PI（碘化吡啶）染色，主要是根据死细胞磷脂酰丝氨酸外翻的原理在流式机器上操作完成，结合Annix-5染料进行双染，可直接识别死细胞及凋亡细胞，操作简便，结果观察更为直观、准确。为临床及科研广泛采用。

is2011[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。我都用过，你的方法没用过，如果可能的话，能否给点样品，我们实验室学生很多，经常做细胞活性检测。

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

给大家介绍一种测定细胞活性的方法,大家可以自己跟MTT比较一下
原理：Sulforhodamine B (SR是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。
材料与方法：1。其细胞接种与MTT相同。
2．SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3．倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4 每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5．结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解
6 用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值
本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。
MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点.当然SRB法操作比MTT复杂一点,呵呵,但是时间可以自己掌握,不受测试时间的限制

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小中大

Trypan Blue 台盼蓝排斥试验
我做的感觉很简单比较适合原代培养的细胞
原理：
细胞损伤或死亡时1，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。
用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1. 制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2. 染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3. 计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞
结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

DDD[使用道具]
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发表于 2012-2-13 14:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提问：
谁能提供关于mtt实验前测定细胞贴壁率、倍增时间和不同细胞数条件下的生长曲线的方法？？谢谢！
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我不知你提这个问题是不是看了司徙先生的《细胞培养》一书中关于MTT试验的方法，因为它上面是要求先做这些，但这本书上就介绍了这几个参数的测定方法。
另外，我也是准备做MTT，我在站内找了很多关于MTT试验的贴子，还有就是司徙先生的《细胞培养》一书，看后还是有些困惑：1.关于空白对照孔(兼调零孔)加液，书上和一部分人说是只加培养基，也有和我一样理解为应加培养基、MTT、DMSO，一起相同步骤后对照，从我预试验的情况看，培养基(我的是DMEM/F12)是红带黄色的，而加了DMSO后的试验孔的液体是呈蓝色，我想两种明显颜色不同的液体怎能设为对照？所以我理解空白对照(兼调零孔)应为一同加入MTT，DMSO；2.对于测定波长，为什么不同的资料会没个一致的看法：书上说是490、Roche公司(ATCC公司也是)产品说明上说是550-600/>650,还有说是570/630(nm)，我预试验的情况是用490/630nm,结果对照兼调零孔的值比试验孔的还高!
再有，看了这楼战友的高见，我想改用CCK-8了，我养的是星形胶质细胞。
希望高手指点一二。

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