细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:[讨论帖]细胞活性测定方法专题讨论

盼盼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75364
精华 0
积分 266
帖子 232
信誉分 100
可用分 1976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
71
 
我购买的是国产的试剂,后按这个方法配制(5mM WST-8, 0.2mM 1-methoxy-PMS, 150mM NaCl)但是实验结果总是不理想。我做的是原代细胞DC,过几个小时后会加入自制的混合淋巴细胞(也是原代)培养三天后加入cck-8溶液,过1-3小时450nm检测,但是结果总是不好,看了各位的指导,想请教这里面的问题。1:培养基含有酚红,并且培养三天后直接加的cck8,这里问题在哪?2:我配制的培养基或者是CCK8有无问题?3:加入CCK8后无培养时间越长,无论是对照还是空白的值都超过0.6。
问题实在是太多了,真的希望能尽快帮小妹解决。谢谢!
顶部
fklo83[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76573
精华 0
积分 344
帖子 368
信誉分 100
可用分 2661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
72
 
我不知你提这个问题是不是看了司徙先生的《细胞培养》一书中关于MTT试验的方法,因为它上面是要求先做这些,但这本书 上就介绍了这几个参数的测定方法。
另外,我也是准备做MTT,我在站内找了很多关于MTT试验的贴子,还有就是司徙先生的《细胞培养》一书,看后还是有些困惑:1.关于空白对照孔(兼调零孔)加液,书上和一部分人说是只加培养基,也有和我一样理解为应加培养基、MTT、DMSO,一起相同步骤后对照,从我预试验的情况看,培养基(我的是DMEM/F12)是红带黄色的,而加了DMSO后的试验孔的液体是呈蓝色,我想两种明显颜色不同的液体怎能设为对照?所以我理解空白对照(兼调零孔)应为一同加入MTT,DMSO;2.对于测定波长,为什么不同的资料会没个一致的看法:书上说是490、Roche公司(ATCC公司也是)产品说明上说是550-600/>650,还有说是570/630(nm),我预试验的情况是用490/630nm,结果对照兼调零孔的值比试验孔的还高!
再有,看了这楼战友的高见,我想改用CCK-8了,我养 的是星形胶质细胞。
希望高手指点一二。
————————————————————————————————————————————————————————————————
1,我觉得空白加不加培养基,主要看你的培养基对最后的数值影响大不大,我门用的1640,加了之后和只加DMSO,MTT的OD值差的并不 多,而且我觉得最后你的所有值都要减去这个空白对照,所以影响应该不是很大吧.
2,我们用的酶标仪#3的时候就是490nm#4的时候是630nm,我们一直都 是用#3
我觉得#4肯定不行吧,差太远了!你的结果"对照兼调零孔的值比试验孔的还高"是不是因为你倒MTT的时候把细胞都倒掉了??或者其他原因??
顶部
fklo83[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76573
精华 0
积分 344
帖子 368
信誉分 100
可用分 2661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
73
 

补充一点,刚忘了:因为加MTT试剂孵育产生了甲赞沉淀后,都是把原来的培养基和药物全部清除,只留下沉淀,然后再加DMSO溶解沉淀,上酶标仪。如果在吸弃上清的那一步做得好的话,那空白对照里加的什么对OD值的影响应该是微乎其微的。
一般做MTT的调零孔是用DMSO,空白对照是用单纯的培养基
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
74
 

最近也在做MTT,用的是贴壁细胞,发觉细胞数为10000个/孔时效果较好。
顶部
pengke1983[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 78619
精华 0
积分 470
帖子 639
信誉分 100
可用分 3986
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-1
状态 离线
75
 
我做过的台盼蓝和MTT 实验:

台盼兰染色法价格低廉,操作简单,又不用无菌操作,做这个实验只要是把显微镜调好了,细胞浓度调好了就不会有问题,是一个养细胞的入门实验,所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度,排除浓度过大引起的毒性反应。

MTT性价比最高,操作上也不复杂但是也要注意一些地方:
1. 刚开始做MTT 实验的时候,结果的稳定性及重复性不好,后来查资料发现,MTT实验的最后OD值要控制在0.75--1.25之间,这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后,所得到的数据还是令人满意的。
2. 一定要保证每孔细胞数相同,这一点很重要,所以一定要充分混匀,边加边吹打,尽快加完。
3. 尽量用新的96孔板,同时加样时注意准确,吸弃上清时,尽量小心,不要吸起沉淀,以减小误差。
4. 血清浓度对MTT实验也有影响,尽量不高于5%,因为如果蛋白质含量高了,加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现,最后的沉淀很难溶。
5. MTT试剂一定要注意避光,如果变绿了,就绝不能用了。
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
76
 

楼上各位,

台盼蓝 如果用孔板来做,那不是很麻烦吗?

每组孔都要消化,染色~~
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
77
 
请教各位老师,我在细胞活性检测方面刚起步,不知道有人做过刃天青检测法没有?我现在想用这个做。谢谢!
顶部
bananapeople[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75315
精华 1
积分 492
帖子 620
信誉分 102
可用分 3964
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
78
 

我也做过不少MTT的实验,感觉重复性不好,我上半年做的实验结果跟我下半年重复做的结果相差很大,光静下明显看到细胞死亡很多,MTT测出来却和没有多少细胞死亡的相差很小,实验结果根本就没法用。感觉干扰因素太多。听老板说要发国外的文章是不能用MTT的。
顶部
zzzz[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74598
精华 1
积分 656
帖子 967
信誉分 102
可用分 5638
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
79
 

不知能否提供SRB方法的原始文献?我最近也在使用这个方法,发现接种细胞数目在6000时测得的空白组和药物组的OD值仍然大于2,是否应该继续降低接种细胞的数目?另外也想看下原始文献了解下实验原理。谢谢,不胜感激!
顶部
yysr238[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79378
精华 0
积分 400
帖子 480
信誉分 100
可用分 3233
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
80
 

有谁用MTT测过脂肪吗?具体步骤是怎么样的?我做了几次但是最后一步不管是加DMSO还是加异丙醇或是加SDS,都发现已经变成紫色的脂肪细胞还是成团地浮在上层。这样的话怎么用酶标仪测吸光度呢?高手们有什么建议吗?讨教了。
顶部