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标题:[求助]3T3-L1诱导分化遇到困难!

plaa[使用道具]
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现在我用新买的细胞,在第三天就可以看到脂肪颗粒了。第四天较为明显,看来细胞的状态与分化情况有较显著的相关性,在加药的时候,发现乙醇溶剂(0.25%)有促进脂肪沉积的作用(相关文献也有报道)!
所以在这提示一些战友:一些脂溶性分化诱导剂最好用DMSO或其他方法溶解,以除去乙醇对实验结果的干扰。
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cocacola[使用道具]
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各位群友,俺这里有点配方,供大家参考
胰岛素,用0.01N盐酸溶解
DMX:用无水乙醇溶
IBMX:用溶液A(1.22ml 14.8N氨水+18ml甲醇+16.98ml水)溶
氨水实为浓氨水
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04906[使用道具]
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大家好!
我养3T3-L1细胞一个多月,细胞生长一直非常招人喜爱,但是诱导分化将近一个月一直没有成功,甚是苦恼,希望各位有成功经验的XDJM不吝赐教,先谢了!
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首先,我到现在还未把握“接触抑制”在镜下观察到底是什么样子?是指细胞和细胞之间生长到完全没有间隙还是指细胞的触角接触在一起呢?我曾试过在细胞生长到完全没有间隙之后两天开始促分化,但这时在低倍镜下只看到密密麻麻的一片,细胞的轮廓都不好辨别了,高倍镜下观察细胞似乎还有重叠现象。
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其次,刚进行诱导分化时细胞脱落现象明显,曾怀疑过是否胰岛素浓度过高,所以1、2、5、10微克/毫升的胰岛素都试过(IBMX均为0.5mM,Dex均为1.0微摩尔/升),均未能成功出现可爱的脂滴。
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我的3T3-L1购自上海,6月初开始养的,传代绝对没到20代,所以促不成功的原因中应该可以排除“20代后”的可能;促分化我一直是在corning的25cm2塑料培养瓶或六孔板中进行,不知大家都是在什么器皿中做的?促分化时的细胞器皿是否对促分化有影响?
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04906[使用道具]
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还有,我用的IBMX是sigma的,用DMSO溶解,但在4度冰箱里会凝固,室温下溶解后加入六孔板中它就直接贴在板底形成结晶,将六孔板放入培养箱5分钟左右结晶溶解,但此时镜下观察结晶处没有细胞了。地塞米松和胰岛素都不是在sigma购买而是在病房拿的,不知促分化不成功是否与这二者的来源有关?另外,大家都是把这三种物质配好在培养基里还是直接加呢?
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根据我的经验,提供以下几点参考意见:
1,一定要在细胞状态好的情况下诱导分化,3T3-L1长得非常快,如果长满以后不换液,会有大批细胞死亡,判断细胞好坏的标准是cell confluent 后,培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大,最好在10*4数量级,这样让细胞长3天后铺满,再换液,再让细胞长2-3天,这时的细胞会退出生长周期,进入growth arrest状态。
2,IBMX的溶解方法有多种,不同文献有不同方法,DMSO,乙醇,浓盐酸,KOH溶液都可,针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试,即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH,
3,胰岛素浓度大一点只会促进分化,不会有抑制作用,因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少,所以需加超过生理浓度的insulin,以其激活细胞膜上的IGF1受体,通过IGF1通路来诱导分化。
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我的细胞尽管长得很快,但我也在怀疑它的状态问题。当细胞长到80-90%是就有一部分细胞变成圆形,轮廓变得不很清楚,而且细胞胞浆里有一些颗粒样的东西使得细胞整个看上去都不十分干净清晰,不知这是不是细胞状态不好的表现?
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tudou85[使用道具]
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大家的分化现在都做的很好啊!只是这个诱导分化剂的溶解配制好像还是不清楚啊!大家再讨论一下吧!
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