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标题:[讨论帖]起来分享大家在细胞培养中的“独门秘技”

star#room[使用道具]
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楼上说的一点没错,各项操作做好了,细胞要想污染也是很难的。
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feima+[使用道具]
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谢谢LZ的经验分享!请教一下,我现在在养luc-hepa1-6(一种小鼠的肝癌细胞系)前段时间养的挺好,最近越养越差,不知lz有没有养过这种细胞,有什么要注意的,谢谢!
现在实验什么都准备好了,就是没有细胞,急啊!我消化时用的是0.25%的胰酶约1-2min,10%的DMEM

“ 请教”不敢当,一起交流。您这种细胞我没养过,但细胞株一般都还是比较好养的。既然前段时间养得挺好,又没有污染,只是状态越来越差,我建议先将血清加到 15%(甚至20%),过段时间细胞长皮实了,再换回10%。同时注意下培养液的pH,而且再急也不要天天去看它,可以隔天看一眼,视具体情况处理就行。细胞拿出培养箱时不要忘了把盖拧紧,放回去时也不要忘了把盖拧松。不要着急,准备工作本来就很费时费力,同时又很重要,真正上实验也就那么一会儿,从复苏细胞到真正做实验花一两个月时间很正常,如果是原代培养更费时间。

不太同意加血清的方法,癌细胞系10%一般已经是比较高了,原来长的很好而后来不太好了,很多情况下与培养条件有关,比如培养瓶,是不是一次性的,如果是,可能这一批质量不够好,如果不是,检查一下是不是瓶清洗的不好,如里面是否有残存的细胞渣,或流水清洗不充分;再比如是否是新换的一批培养基,尤其是否新换血清了,这种情况比较多见,如果是建议换一批好点的血清,等等,应该多找找这些方面的原因。再有一种情况就是是否有支原体或酵母菌污染。

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对,我同意楼上的观点,我们现在养的肝癌细胞,用的是5%的血清,细胞生长速度和生长状态都还不错。细胞状态不好了,有可能是培养瓶没洗干净,我们就遇到过着这种情况。再有就是血清的质量问题。这都比较关键。
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看完了,发个言,
关于培养瓶横着放竖着放的问题,个人认为咋放都行,别管风向,我的超净台是垂直风,我的培养基是垂直放,一旦开盖,直到实验终点都不盖盖子,培养瓶横着竖着放都做过,过灯和不过灯都试过,从来没有污染,当然是有诀窍的:注意瓶口,病从口入,只要瓶口注意了,就不用怕!第一次培养的时候我用了快30根吸管,就因为不小心碰到了不该碰的地方,或者忘记了这根管是干什么呢,幸亏我当时高压的多,现在几根就够了。

一点感慨:下多大功夫,就收获多大;饭不好吃,只是因为没有做好!细胞不好,只因为没养好!

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同意!我们一开始也是用好几根吸管,现在如果换个液什么的都不用吸管,直接口对口倒!也从来没有污染过!关键是操作之前操作之后瓶口都要烧!绝对没问题!
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feima+[使用道具]
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3 吸走培养基的培养瓶我给躺着放(我想不然贴壁的细胞都下来了),后来被批了,极易污染,要立着放?

请教高手是这样的吗?

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就是,谁批的你啊?我们超净台的风是由下往上吹的,可以防止灰尘细菌掉落,所以培养瓶躺着放就可以。不过即便是立着放,贴壁细胞也不会掉下来的,没那么容易掉下来的。
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xingyi08[使用道具]
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都是很好的帖子,受教了,我很快也要开始养A549了,师兄养了一两个月都老出状况,没成功过,搞得我现在蛮紧张的。
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mickeylin[使用道具]
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都是很好的帖子,受教了,我很快也要开始养A549了,师兄养了一两个月都老出状况,没成功过,搞得我现在蛮紧张的。

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没有那么难的,不用紧张,细心些,耐心些,注意无菌,好好照顾细胞就行。慢慢就会摸出点门道来的。
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is2011[使用道具]
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看了那么多人都说了自己在细胞培养过程中的心得体会,我也说说我自己的,养细胞快半年了,从师姐、师兄那里学到了一些经验,自己也总结了一些,和大家分享一下:
1、放在四度的培养液、PBS、胰酶等在用之前,都需先放到超净台里照半个小时紫外,我们实验室都将这些东西装在玻璃瓶里,不用担心会被紫外破坏。这样既可以起到杀菌作用,又能让培养液、PBS等升至室温。
2、细胞间一般都会有大紫外,用来给细胞间杀菌,我们实验室大紫外的开关是设在细胞间外面的,所以,每次进去之前都要确定大紫外是否关了。有发生过没关大紫外就进去的情况,我有个同学,是另外一个实验室的,被照了两次,每次都照了超过一个小时,这对身体伤害是十分巨大的。还有就是开大紫外的时候一定要把日光灯给关了,否则,一是杀菌效果大减,二是万一没关大紫外进去,很难发现。
3、细胞间要定期大扫除,保持细胞间的清洁。
4、东西从超净台外面进入超净台都应该喷70%酒精消毒。
5、超净台里面的东西放置要符合自己的习惯,一切以安全,方便为原则。
6、条件好的实验室,手套用一次性的,要穿消毒的衣服。条件不够的实验室,手套可以重复使用,但是,每次都要照紫外杀菌后才能用,没有专门衣服的,最好带一个消毒好的袖套,这样也能减少染菌。
7、关于细胞消化,我用的方法和上面一位战友的差不多,就是将旧培养液倒掉之后,用PBS洗一次,然后加1mL胰酶,将全部细胞浸润后就将胰酶倒掉,这时,如果你不清楚消化时间,可以盖好盖子,拿到显微镜下观察,看到大部分细胞都变圆,细胞间隙逐渐清晰的时候,就说明消化完全了。这时,我们会用手握住瓶子,重拍两三下,细胞就都下来了,也就像前面一位战友说的“流沙状”。再加1mL培养液终止就好了。新的细胞一般最好镜检一下,消化几次后就会知道大致的时间,就可以省掉镜检这一步了。
8、养成好习惯,及时将染菌的细胞或者不要的细胞拿出细胞间,以免贻害无穷。

能想到的暂时只有这些,以后有再想到的再补充。欢迎大家积极讨论,分享大家细胞培养的经验
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兔唇[使用道具]
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看到好多战友在说培养瓶的放置问题,我的那两瓶细胞最终都很好!

不过我个人感觉,开口的培养瓶还是竖着放好。到了后来吸管用的越来越少了,培养瓶就充当了放吸管的功能!

我们细胞室养的细胞品种不多,现在我已经能很熟练地养细胞了!

初学者只要多用心,勤总结,做细胞前做足功课!细胞们就会快快活活的生长的!
战友和细胞们!五一快乐!
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yueban-1147[使用道具]
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我现在养SP2/0细胞,刚拿回来时时用10%小牛血清培养的,拿回来后我用的是胎牛血清。一开始状态还可以,但是最近不知道为什么,有些细胞的形状竟然很奇怪,像伸出伪足一样的,不再很圆很亮,有点类似于贴壁细胞的形态。形状改变的细胞有的变成梭形,有的变成海星状。这样的细胞亮度不高,体积比较大。小声问一句,是不是细胞返祖了?
这是什么原因呢?绝对不是其他的细胞污染,是不是跟培养基PH值,用力吹打有关系?
还有SP2/0细胞是不是很脆弱,拿出来观察其状态,过不了几分钟状态就不好了。大家有这种情况吗? 大概要2个半月以后才用这个细胞,我有必要把它冻起来么?谢谢大家!
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我还有一个问题,我养的是半贴壁的细胞,传代后原来的培养瓶仍部分细胞继续培养,但是状态不是很好,是不是细胞培养瓶(玻璃的,不是一次性的)不能用时间太久啊?
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