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标题:[讨论帖]做树突状细胞的同行们请进

cj_mondy[使用道具]
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培养至第6、7天的DC,用不着用胰酶消化,此时的DC贴壁很疏松,只要轻轻吹打就下来了,用胰酶消化,反而回混经杂细胞。悬浮细胞和贴壁细胞的说法太笼统了。培养早期,悬浮细胞主要是淋巴细胞,而DC或DC的前体细胞和巨噬细胞等是贴壁的;晚期,淋巴细胞应该已经清楚了,此时DC已疏松贴壁了,悬浮细胞应该主要是DC。因此,在培养中笼统地以贴壁和悬浮来区分细胞很不科学,也指导意义和实验意义。如果单纯讲DC的比例,影响因素也很多如:培养技术、细胞因子(特别是GM-CSF )的活性、培养过程中处理等都会严重影响DC的数量和状态的。DC培养第7 天后,细胞数肯定不会大量的增加了,因为,此时DC已接近成熟,即将进入凋亡阶段了。
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我从小鼠脾脏分离细胞,然后用BD公司的PAN DC分离磁珠分离树突状细胞。培养后发现有不少带有较大突出的细胞,我觉得应该是巨噬细胞,怎样才能提高分离的纯度呢?我的实验只需要用树突状细胞和B细胞共同培养几天而已,只是用了10%FCS的RPMI1640,没有加GM-CSF等其他因子;原来看文献大都用96孔板做10个孔,我嫌麻烦,直接用了24孔板;这些有影响吗?还有哪些需要注意的事项?我对树突状细胞懂得很少,刚开始这方面试验,希望各位大侠能指教一二,多谢啦!
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我以前培养DC都是用24well或6well板的,很少有人用96well的。如果从骨髓细胞中诱导培养DC不加GM-CSF是肯定培养不出DC的,不知你的实验目的是什么?如果只是测试脾脏中的DC对B细胞的作用,那就不用GM了。如果是测试小鼠体内的总DC群,为什么不取骨髓细胞来诱导培养呢?脾脏DC的数量是很少的。如果没有没有rmGM-CSF或嫌贵,我可以赠送5ug(自己重组的,效果绝对良好)。邮箱:ivy_1968@126.com。另外,DC是没有绝对特异性标志的,我不明白如何用磁珠分离?如不嫌麻烦望将说明书或原理发给我看看,以提高我的认识。
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多谢指教,我只是看DC对B细胞的作用,养几天就行了。问了前辈,看了一点文献就照着做了。很多东西都不懂,正在边做边学习原理,DC的原理实在是很复杂,我原来是做临床的对免疫几乎一窍不通,真是很难。我用的是Miltenyi Biotec公司的PAN DC磁珠分离,它好像是用了CD11c 和 Anti-mPDCA-1的抗体磁珠 。具体资料可以查看网页cuturl('http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_643_Pan_DC_MicroBeads.aspx')。很抱歉我的电脑现在没法正常下载pdf文件,无法把说明书下载发给你,要麻烦您自己去下载了。我不太懂用磁珠分离得到的DC和诱导得到的DC到底有什么区别?看了这里的一些帖子发现大家都用GM-CSF诱导培养,是因为细胞太少才需要这么做吗?(很抱歉我的问题大概很无知),做了几次发现脾脏中分离到的细胞大概只有1%左右,而且感觉纯度不高。显微镜下看觉得有巨噬细胞,不知道对B细胞的影响会不会是巨噬细胞造成的,希望能提高纯度。
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cj_mondy[使用道具]
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DC是很复杂的,其实任何真核细胞都是很复杂的,如果我们人类能完全研究清楚一个细胞,也就完全解开生命的全部奥妙了。毕竟,任何多细胞生物都是由一个受精卵细胞分化发育而成的。
DC是没有特异性表面标志的。许多DC表面高表达的分子在巨噬细胞、单核细胞也有表达。至于CD11c在其他细胞上的表达我也不清楚,但我看过不少关于DC的文献,印象中没有人用磁珠分离DC的。至于现在是否有新进展,可用磁珠分离,我也不敢轻易否定。
DC在外周血中也有存在,1%?我记不太清了。我想脾脏中的比例也大致差不多。用如此少的细胞来做实验,而且分离时又不纯,估计实验是有困难的,实验过程中稍有误差,结果就不可信了。我想这也许是人们要诱导培养的原因。
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谢谢啦,看来还需要多读文献。我们这里好像习惯用磁珠分离各种细胞,T细胞,B细胞等等,不知道是不是因此也用磁珠分离DC了。
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cj_mondy[使用道具]
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T细胞、B细胞包括CD34+的骨髓干细胞都是可以用磁珠分离的,因为它们都有特异性的表面分子,而DC是没有特异性的表面分子的,而且本身也是异质性很高的细胞群,所以很听说用磁珠分离的。
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