细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [讨论帖]做树突状细胞的同行们请进

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 107  3/11 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[讨论帖]做树突状细胞的同行们请进

gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
21

发表于 2012-2-24 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，我不是原代培养的，我养可传代的DC细胞株，不过对DC的分离还是有一点了解的，毕竟我差点就原代培养了。
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
22

发表于 2012-2-24 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，我不是原代培养的，我养可传代的DC细胞株，不过对DC的分离还是有一点了解的，毕竟我差点就原代培养了。

请问，你的DC细胞系是什么名字？小鼠的还是人的？还有一个问题想请教，DC细胞建系后的状态是成熟的还是未成熟的？谢谢！
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
23

发表于 2012-2-24 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

给大家介绍一个能够更好的分离高纯度单核细胞的方法，简单步骤如下：
Step 1: 取回抗凝白膜,用等体积的DPBS稀释;10ml/份置于15mlFicoll之上,400g,20分钟;
Step 2: 吸出white band,15ml/份,稀释在35mlDPBS(含1Mmedta,PH值7.2)或者生理盐水中,150g离心10分钟,移走上清中的血小板;反复两次
Step 3: 细胞重悬在完全培养基(IMDM)中,计数;
Step 4: 细胞被进一步稀释为1-2×10^6PBMC/ml, 25ml/份,轻轻的置于
46%的Percoll [46ml等渗Percoll (9.25mlpercoll/0.75ml 10×DPBS) +54ml含酚红的完全培养基]上, 不间断离心550g, 30分钟;
Step 5: 离心后,单核细胞在上下两层的中间,淋巴细胞在最下面.

这样得到的单核细胞纯度较高，而且Step1的稀释和step2的洗涤可以大大减少血小板的污染，尤其是step1！
顶部
cocacola[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77403
精华 0
积分 534
帖子 747
信誉分 100
可用分 4576
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
24

发表于 2012-2-24 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的是小鼠的，不过穿了几代后被我养死了，我都不知道出了什么问题，下次复苏我再试试，有没有人对DC2.4有培养经验的啊，***求知道啊？
顶部
mickeylin[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79369
精华 0
积分 461
帖子 582
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
25

发表于 2012-2-24 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是脐带血分离诱导培养DC，但是也是发现有好多杂细胞，其中有些贴壁，有些较小悬浮，而且诱导出来的细胞大小相差较大，大的细胞在光镜和电镜下都发现线粒体较肿胀。不知道如何解释？
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
26

发表于 2012-2-24 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用正常外周血和浓白的分离步骤是一样的。只是第一步离心时用的梯度离心液的量不一样，因为同体积浓白中的细胞更多，离心液用得也多（15 mL in 50 mL tube）。我的目的只是要拿到DC，所以用浓白效率较高；有人是为了研究患者的DC，所以是采外周血。
我后来又分离培养了4次DC，只要离心速度（尤其是清洗时）合适，不会有问题。还有，我不知道你的DC养在哪里，我是养在24孔板里。据说是1~2 * 10（6）/孔的密度，但我觉得用0.5 * 10（6）/孔 更好，后来收的DC更多。
那个贴壁再洗的方法不知道你试过没，我算了一下，洗一次大概损失15%的细胞（心疼啊~~~），不过为了纯度，只好忍了：）
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
27

发表于 2012-2-24 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问Step1中的的抗凝白膜是不是就是直接从血站拿的浓白？
我感觉血小板比较“轻”，梯度离心似乎很难除掉，倒是Step2的清洗很重要。
另外Step4中的细胞需要严格调整浓度吗？因为我没调过，而暂时也没出问题~~~
还有就是血小板和细胞碎片在光镜下看有什么区别呢？用多少放大倍数能看出来？ 我一直对这个比较晕：）
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
28

发表于 2012-2-24 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的传代是什么意思？ 我是把DC分出来之后养一周，然后刺激两天，收获成熟DC，中间再第三、五、七天的时候半量替换培养基。
还有请问什么是DC2.4？
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
29

发表于 2012-2-24 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你发现细胞贴壁和悬浮是在养了几天之后？
较大的贴壁的细胞形状是不是扁的，伸出长的“触角” （不好意思，非专业描述^^）？如果是的话，就是巨噬细胞。
较小的悬浮的细胞是不是圆形的？如果是的话，应该是DC。除了刚开始的几个小时，DC在培养过程中是悬浮的。
另外，你能把DC的照片传上来不？ 我们这儿的光镜不能拍照~~~
还有我最近也想试试做DC切片，然后看电镜，不知道具体应该怎么操作，还请你多多指教！
多谢啦：）
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
30

发表于 2012-2-24 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问大家是用什么方法鉴定成熟DC的？
我是用CD86-FITC和CD83-PE联合标记，然后用流式鉴定。但我做的流式中CD83-PE的荧光强度总是偏低，不知道是怎么回事？
顶部
 107  3/11 ‹‹12345678910›››|