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一、
1、采集外周血15ml，0.2%EDTA抗凝。
2、0.2%EDTA抗凝血100μl ，加入10ul FITC-anti-lin mAbs, anti-HLA-DR mAb,PE- anti-CD11c mAb or PE- anti-CD123 mAb，充分混匀，避光冰浴30min。
3、加入1x红细胞裂解液1ml,振摇2min。
4、2000rpm、6min、200C离心，弃上液。PBA(2.5%FCS) 500ul重悬。
5、2000rpm、6min、200C离心，弃上液。PBA(2.5%FCS)重悬。
6、调整细胞浓度 ( >5x104/sample),上机检测。
7、计算pDC:mDC
二、
1、分离PBMC
2、10ul FITC-anti-lin mAbs, anti-HLA-DR mAb,PE- anti-CD11c mAb or PE- anti-CD123 mAb ，避光冰浴30min.
3、2000rpm、200C离心6min，弃上液。PBA(2.5%FCS) 500ul重悬。
4、 2000rpm、200C离心6min，弃上液。PBA(2.5%FCS)重悬
5、上FACs分选pDC and mDC
6、分别用pDC or mDC 体外做MLR。
问题：
1、上述的实验步骤是否正确？
2、分离PBMC 后是否需要培养过夜，再做pDC or mDC 的分选？培养过夜对pDC or mDC 会有影响吗？如成熟度，活性等。
3、分选后的DC是否应该马上做MLR？还是要培养一段时间再做？
（因为要看病人和正常人外周血DC的不同，所以担心体外培养会改变DC性状）
4、完成上述实验，一般要多少血？即1ml外周血能分离多少DC？
5、MLR要做几个复孔？
6、上FACS分选，一般多少细胞数加多少ul荧光标记抗体？每管细胞数为多少比较合适？
不好意思，我是新手，我们实验室有没人做过免疫方面的实验，因此有些问题可能会很幼稚，请不要介意。但是我真的很着急。
