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我做DCs已经半年了,现在养的DCs性状非常典型。用的是从血站买的浓白诱导的。具体的方法如下:
1. 将浓缩白细胞用PBS稀释至总体积50ml,分两管(50ml离心管)加至Ficoll上,第一管血加完后尽量把泡沫打进去,以增加缓冲力。
2. 2000rpm离心,30min,不能有刹车。
3. 吸取白膜层,交替多次吸取,尽量吸干净,用PBS补齐体积至50ml.
4. 1500rpm离心,15min, 以去掉Ficoll。
5. 弃掉上清,留少许液体,轻弹管底,以使细胞松散,加入PBS至50ml.
6. 800rpm离心,10min,以洗掉血小板。
7. 重复上述操作2次。
8. 在第三次加入PBS(总体积50ml)后,稀释5倍进行细胞计数,
9. 离心结束后,按细胞数目铺板,通常一份血铺两块六孔板,每孔细胞数1x107,培养液为无血清1640+DNA酶(10U/ml)+三抗。
10. 贴壁两小时后,轻晃培养板,PBS洗板2-3次,加入完全培养基培养。
11. 三天后换液,每孔加入2ml完全培养基。