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标题:[讨论帖]做树突状细胞的同行们请进

misswu61[使用道具]
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我分离出小鼠骨髓细胞,用细胞因子诱导培养DC时遇到一个现象:我把细胞均匀分在24孔板里,几天培养下来,细胞数量没有明显增加,有些孔干脆就找不到细胞了。请问这是怎么回事?

————————————————————————————————

培养期间是否进行换液(含细胞因子),最好初始浓度在2*106左右。
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one[使用道具]
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52
 

我是培养小鼠骨髓源树突状细胞,
感觉是一个漫长的过程,
先是如何分离得到小鼠骨髓就花了很长一段时间。
由于细胞因子贵,开始没加任何因子培养,
观察贴壁和悬浮细胞。
这是导师叫我练练手,熟练了再加各种因子。
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whitesheep[使用道具]
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53
 

不好意思,请教一个问题,第三张照片是不是树突状细胞的免疫荧光照片,其中绿的红的,哪个才是树突状
应该是红色荧光的才是树突状细胞。
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66小飞侠[使用道具]
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我做DCs已经半年了,现在养的DCs性状非常典型。用的是从血站买的浓白诱导的。具体的方法如下:
1.  将浓缩白细胞用PBS稀释至总体积50ml,分两管(50ml离心管)加至Ficoll上,第一管血加完后尽量把泡沫打进去,以增加缓冲力。
2.  2000rpm离心,30min,不能有刹车。
3.  吸取白膜层,交替多次吸取,尽量吸干净,用PBS补齐体积至50ml.
4.  1500rpm离心,15min, 以去掉Ficoll。
5.  弃掉上清,留少许液体,轻弹管底,以使细胞松散,加入PBS至50ml.
6.  800rpm离心,10min,以洗掉血小板。
7.  重复上述操作2次。
8.  在第三次加入PBS(总体积50ml)后,稀释5倍进行细胞计数,
9.  离心结束后,按细胞数目铺板,通常一份血铺两块六孔板,每孔细胞数1x107,培养液为无血清1640+DNA酶(10U/ml)+三抗。
10.  贴壁两小时后,轻晃培养板,PBS洗板2-3次,加入完全培养基培养。
11.  三天后换液,每孔加入2ml完全培养基。
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tangxin_80[使用道具]
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我们用CD209(DC-SIGN)和CD14来鉴定DCs的纯度。CD209在DCs表面的表达高于95%。其实目前还没有DCs特异性的鉴定标志,一般用组合的方法来鉴定
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ququer787[使用道具]
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DNA酶和三抗的作用?傻傻地问。
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ququer787[使用道具]
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何时加GM-CSF和IL-4?是贴壁两小时后还是三天后?
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glass[使用道具]
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回复 #57 ququer787 的帖子

贴壁两小时后两小时后,洗净淋巴细胞后加。三天后换液。
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glass[使用道具]
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请问大家:
有没有出现过板中间形态大小均一的圆形细胞?那是什末东西?请帮忙解答,谢谢。
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ququer787[使用道具]
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GM-CSF和IL-4的浓度多少,如何确定的?必须加CD40L吗?为什么?如何确定成熟与未成熟的DC——流式是唯一的吗?
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