[资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得 - 经验共享

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标题:[资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得

newway[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前打算分离脐带血造血干细胞（CD34+细胞），考虑到经费等原因，没敢用免疫磁珠法分离，而从文献中找到一个相对流式和磁珠分离法较便宜的多的方法：两步贴壁法分离脐带血CD34+细胞。

大致步骤：先分离脐带血单个核细胞，放入培养瓶中过夜培养，去除贴壁细胞，收集悬浮细胞后用培养液调整细胞浓度至适当量，加鼠抗CD34单抗，混匀4度作用1小时，再将此混合液移入预先包被好羊抗鼠IgG(H+L)的培养瓶中，4度作用1小时，到掉悬浮细胞，加入培养液用力吹打下黏附细胞，此即为所需的CD34+细胞。分离后一般要用流式细胞仪来做一下纯度分析。

上面是我的实验步骤，不知对你有无帮助，只作参考。

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很好,我觉得,淋巴细胞分离后,最主要的目的还是培养得到的细胞.
我养的细胞都是经抗原刺激的,okt3, okt8,mtb多肽等都用过,
一般的pbmc培养,都用10%FCS+1640 ,不加入rIL-2,一个星期左右就会死亡,若是加入了抗原,在抗原的刺激下,即使不加入rIL-2 也能很好的生长.
记得有一次,我把失效的rIL-2加到了细胞悬液内,结果:不加抗原刺激的细胞全布去见了马克思,而加了抗原的生长完全正常.培养最多的天数超过30天~~

建议:加rIL-2培养细胞时,rIL-2保存在4度不能太久.rIL-2 的浓度越大,能保存的时间越长.最好用的时候,分装成1ml/管,其他的放到-80度保存.

duoduo[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用脐血分离培养淋巴细胞多次，感觉：
（1）不同个体淋巴细胞生长差异较明显
（2）红细胞、血小板并不影响后续工作（我用来种病毒）
（3）经过对比，好象加不加IL-2对淋巴细胞的生长影响不大。这是为什么？

小糖块[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

也做过白细胞分离，不过密度和离心条件是自己摸的，主要是用两步法分离的，看起来血小板没有楼上的这么多

下面是细胞染核的结果，染上蓝光的是白细胞，大的黑的没有染上的是红细胞，小的是血小板 10X20的

附件

2012-3-7 15:22

96625006.snap.jpg (41.17 KB)

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