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标题:[讨论帖]免疫细胞或组织化学染色的相关问题

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-3-13 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的软骨细胞在4%多聚甲醛固定、PBS冲洗之后，晾干后细胞全融了，成了一片结晶， 用丙酮试固定也不行，固定时间从10至60分钟我都试过，细胞在干了之后还是全融了，怎么办？
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qhyu[使用道具]
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发表于 2012-3-13 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做的是一种小分子药物的免疫组化，由于药物极溶于丙酮等有机溶剂，我怕在固定和脱水时对病理组织上的药物有被洗脱的嫌疑，所以我想用冰冻切片。我以前也没做过免疫组化，手头有辣根过氧化物酶标记（单抗筛选时使用的）和荧光素标记的两种二抗以及DAB，不知道做好冰冻切片后具体步骤该怎么做？显色完后再逐级脱水还会不会对观察结果有影响，希望您能不吝赐教！！
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发表于 2012-3-13 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做的是一种小分子药物的免疫组化，由于药物极溶于丙酮等有机溶剂，我怕在固定和脱水时对病理组织上的药物有被洗脱的嫌疑，所以我想用冰冻切片。我以前也没做过免疫组化，手头有辣根过氧化物酶标记（单抗筛选时使用的）和荧光素标记的两种二抗以及DAB，不知道做好冰冻切片后具体步骤该怎么做？显色完后再逐级脱水还会不会对观察结果有影响，希望您能不吝赐教！！

————————————————————————————————————————————————————————————————

既然这样，那就做荧光染色吧！

具体方法：

1。4％多聚固定10－30min，0.01MPBS清洗5min×3；

2。羊血清封闭液封闭（可以加入0.3% Triton X100 ）30－60min分钟；

3。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀释的第一抗体室温反应1－2h或4℃过夜。吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；

4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的荧光二抗，室温孵育1－2h。

5。吸去二抗，0.01MPBS洗一次，直接用50％甘油封片，进行观察。

good luck！
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qhyu[使用道具]
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发表于 2012-3-13 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哪还可以做冰冻切片进行电镜观察吗，如果可以，该怎么操作？谢谢！！是不是觉得我太菜了，主要是我以前没做过，心里没底。
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发表于 2012-3-13 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老板要求我用cytospin来甩片后，做细胞的原位杂交、荧光染色等实验，请问这种离心甩片法与爬片等有什么不同，细胞经胰酶消化后离心会对它的抗原等物质有损害吗？要做细胞的原位杂交、荧光染色甩片后用什么固定比较好，固定时间多长？如何保存片子？（我还没查到相关资料，还不知道要检测什么，只想把片子保留，将来再做打算）各位高手是否给我在这方面的建议！！！，万分感激！
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-3-13 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我细胞化学的一抗是染胞浆，但是从我做出来的片看，无论我用1：50、1：200、1：400的一抗浓度，DAB 都在胞核深染，而胞核却染得很淡。为什么呢？
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 小中大
我细胞化学的一抗是染胞浆，但是从我做出来的片看，无论我用1：50、1：200、1：400的一抗浓度，DAB 都在胞核深染，而胞核却染得很淡。为什么呢？

——————————————————————————————

厂家推荐用多少？？

可以把浓度进一步稀释，如1：500、1：1000、1：2000等！
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发表于 2012-3-13 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教主任：我做细胞免疫组化，部位在胞浆，用苏木精复染核时，为何阳性细胞核很难染上，或兰色很浅，而阴性细胞核染的很好？另外一张片上有的地方为强阳性，有的地方为弱阳性，还有的地方为阴性，是我染色不均匀吗？
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 小中大

请教主任；我做大鼠骨组织的免疫组化，想看骨组织细胞中Fas,FGF-2,TGF的表达情况，用的是石蜡切片 ，是两步法，在用二甲苯脱腊2次，各20分钟后，用无水酒精×2，各5分钟，在用95%酒精×2，各5分钟。接着用0.01M的柠檬酸缓冲液作为抗原修复液，先90度，3分钟，在55度，12分钟。而后，出现严重的脱片，最好加完一抗，二抗，DAB后，片子上什么也没有，镜下可见没有被染上色的骨髓腔中的血细胞，视野中几乎看不见骨组织。之前片子用PLL和APES涂过了。实验室的老师说是骨组织太硬了，一用微波修复就容易漂起来。但又有人说，骨组织用微波修复能作出来，我想请教主任，脱片是微波修复的原因吗？上述有没有其它的步骤可能导致脱片？有什么好办法能防止脱片吗？我在这先谢过了！做不出结果，真急啊！
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nn255[使用道具]
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 小中大

请看：

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