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标题:[讨论帖]免疫细胞或组织化学染色的相关问题

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发表于 2012-3-13 11:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好
用粘片剂包好片子后用高压蒸汽灭菌没有影响吗,我用的是多聚赖氨酸

——————————————————————————————————————

我没有试过，但是PLL是氨基酸类的物质高温高压下会不会对它的效果产生影响？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-3-13 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一个土土的问题，刚刚看到大家经常讨论PBS的浓度，我在一些资料里面也经常看到，我配PBS都是根据鄂征的那本组织培养的书，即：KCl0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4.7H2O 1.56g/L，请问找个浓度化成M，是0.01M还是0.02M？谢谢！
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发表于 2012-3-13 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个土土的问题，刚刚看到大家经常讨论PBS的浓度，我在一些资料里面也经常看到，我配PBS都是根据鄂征的那本组织培养的书，即：KCl0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4.7H2O 1.56g/L，请问找个浓度化成M，是0.01M还是0.02M？谢谢！

——————————————————————————————

一般是0.01M，但是也有用0.02M，可根据自己的实际情况。

PBS的浓度是指溶液中的磷酸缓冲对的浓度。
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yychen[使用道具]
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发表于 2012-3-13 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得洗的时间（1）稍长了一点，不知道你片子质量如何，不是自己挂胶的吧？
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发表于 2012-3-13 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #24 yychen 的帖子

其实这是很灵活的，只要您的结果理想，洗的时间完全可以缩短！
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发表于 2012-3-13 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做的是细胞爬片的免疫组化，用的是DAKO的浓缩型一抗，一抗稀释液DAKO的说明书上没有，我就单纯用的PBS稀释，这样可以吗？另外，我的细胞阳性着色部位是胞浆，染DAB后总是胞核比胞浆颜色还黄，这时苏木素也复染不上，真急人，这是什么原因呢
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发表于 2012-3-13 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #26 101010 的帖子

一抗稀释液的配方一般为（100ml）：牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml

单纯用的PBS稀释当然可以，但是前提是您的封闭的效果一定要确切。从您的情况看，是非特异情况。

按照我前面的方法重复一次，对于大多数的免疫染色都会有结果的！
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发表于 2012-3-13 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗稀释液配好后怎么保存呢，能保存多久，0.3% Triton X100 可以在加羊血清封闭液封闭之前单独孵育吗，因为我买的中山的SP试剂盒，里面的封闭血清是即用型的，免疫细胞化学不需要用0.3%的过氧化氢甲醇溶液消除内源性过氧化物酶的影响吗，我看上面您写的免疫细胞化学染色上没有这一步，为什么呢，另外，中山的SP试剂盒每种试剂孵育时间都较短，是不是应该适当延长，不好意思，一下问了这么多问题，做实验太烦人，我也很着急，只好麻烦您了
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发表于 2012-3-13 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #28 101010 的帖子

Q：一抗稀释液配好后怎么保存呢，能保存多久?
A：4℃保存2个月左右。但是也不是绝对的，只要里面没有长霉菌就可以用。所以如果要保存一段时间，那么叠氮纳是一定要加的。

Q：0.3% Triton X100 可以在加羊血清封闭液封闭之前单独孵育吗？
A：当然可以。30min就行！

Q：为什么在免疫细胞化学染色中没有0.3%的过氧化氢甲醇溶液消除内源性过氧化物酶步骤？
A：体内的内源性过氧化物酶在红细胞中含量最高，所以如果灌注效果不佳组织内残留的红细胞数量多，那么过氧化物酶的含量也就高，到了最后的显色阶段它会和HRP共同作用，使结果的背景色十分高。所以0.3%的过氧化氢甲醇溶液本来是在灌注效果不佳时才用的，不过现在已经成为组织免疫化学的常规步骤。而细胞培养时，细胞自身的过氧化物酶含量是可以被忽略的。所以这一步是可以省去的。

Q：孵育时间是否可以适当延长？
A：如果显色结果比较弱，那么当然可以延长喽！
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发表于 2012-3-13 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
太感谢你了，您的勤劳和热心让我感激涕零，看你懂这么多，我真崇拜你，，所以要再请教您几个问题：
1，30% Triton X100 和0.3% Triton X100 配好后可以室温放置吗，还是需要现用现配？
2，有的免疫组化的步骤上在一抗孵育后还要用10%的蛋清封闭内源性生物素，我看您介绍的免疫细胞化学染色上没有这一步，是不是这一步对免疫细胞化学染色没有必要？
3，我的PBS配方：1000ml蒸馏水中含NaCl 9g，Na2HPO4.12H2o 6g, NaH2PO4.2H2O 0.4g, 你看是不是免疫细胞化学染色中用到的PBS
thank you
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