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标题:[求助]lipofectamine2000的转染率

kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在做Lipofectamin2000的转染，不过是做小干扰RNA瞬时转染，可能跟楼主的质粒转染还小有区别！可以交流一下。
楼主心里很清楚啊！脂质体2000的转染效率跟质粒与2000的比例、细胞的状态、密度以及转染的时间有关，但我个人体会是不能盲从别人的经验，尤其是过分地相信国内文献上的操作步骤！最可靠的还是根据说明书，然后结合自己对要转的细胞习性的把握进行预实验，摸索一下条件！找到最佳的配比、最佳的细胞密度、状态、最合适的转染时间。我个人一些教训可以参考一下，希望对楼主有帮助：
1、细胞状态不好时，千万不要做转染，纯粹浪费时间与精力！一般是选择最佳状态的细胞传代种板，24小时待细胞融合达70-80%开始做！要注意事前算好细胞种板的密度，是不是在做转染时正好细胞融合到70-80%。当然这个24小时也是针对绝大多数细胞，比如我自己的细胞分裂周期要33个小时，我一般是第一天晚上种板，第三天早上转染！所以预先掌握自己细胞的习性很关键！
2、操作一定要轻柔，尤其是用枪配制转染液时！脂质体的原理就是要包裹质粒进入胞内，所以轻柔操作就很关键，这步直接关系最后的转染效率。而且最好配制时是把脂质体加到质粒里，原理一样！
3、转染时尽量减少细胞在孵箱外暴露的时间，尽可能把所有的准备工作都准备好才拿细胞！
4、楼主说的加转染液细胞出现死亡是正常的。因为脂质体对细胞是有毒性的，尤其是快过期的脂质体，所以最好用新的。
祝好运！
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能否说说对悬浮细胞如HL-60细胞的转染情况,(如细胞浓度、配比等），谢谢！
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我作过的hella细胞或ＥＰＣ细胞用lipofectamine2000可以达到７０％－８０％的荧光率（带ＧＦＰ标记），可以说关键是操作的技巧。国外正在卖一种新的转染试剂，可以达９０％上，其内容是在buffer上动了下脑筋，卖得可贵。一般只要按照protocol上操作，基本可以满足实验要求！其中一定注意好细胞生长密度和状态哦！
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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人觉得：转然还不是很难得问题～～

关键是转然后筛选稳定克隆的问题才难～～，太费时、费力～～～！还不讨好 ～～
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中国特色[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

lipo2000转染一般按说明书用量完全可以，不必多加，转染后4-6 小时换液即可，由于其毒性，细胞死亡是正常的
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做转染时注意事项挺多，说明书上也很全。我觉得重要的有这么几点：
1.质粒的纯度。
2.质粒与Lipofectamin2000的比例。质粒浓度的估量挺重要 的。

至于细胞密度，我觉得可能以种类不同而不同，最好自己摸索一下。
生长状态上面都说了，非常重要。不要做了再后悔，浪费时间。
转染的五六个小时，细胞数目少是正常的，在更换完全培养基之前，应该感觉细胞的轮廓非常清晰。
转染荧光蛋白时，应该比较容易达到60-70%。但是转自己的质粒时，表达量 将非常重要。
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发表于 2012-3-15 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为，Lipofectamin2000的效率还是挺高的。我曾为另外一个公司的转染试剂作试用报告，与LF2000相比，毒性是小了，效率上却差了很多。但是LF2000的效率和毒性有的时候也受生产批次的影响，我们实验室因为使用较多，所以试好了哪一个批次的就会买一些备用。我还是推荐质粒与LF2000的比例为1：2，即转染六孔板，我一般常用4微克的质粒和8微升的LF2000。当然，转染效率要看细胞的状态，质粒的纯度，脂质体的毒性，细胞的种类等。转染时，细胞最好处于对数生长期，此时转染效率最高。细胞的种类也很重要，像293A，293T，HeLa等都是转染效率较高的细胞，一般可以达到70%。有一些细胞是很难转的。一般转染6小时就可以了，理论上说不用撤液，但是脂质体毒性还是不小的，应该撤液。若是转染对细胞生长有毒性的蛋白，保持1：2的比例，质粒和脂质体都适当少加。具体某一个细胞系，某一个质粒的操作条件可能还需操作者自己摸索。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得具体的转染效率要看细胞，我们曾经同时转染过一种肿瘤的两个细胞系，结果一个转染效果很好，另外一个基本没转染进去。
再有，我觉得lipofectamine2000的转染效率不如他们公司之前的产品lipofectin好，我们曾经同时用这两种转染试剂转染过同一种细胞，后者的效率明显好于前者，而且毒性要小，但是不知道为什么invitrogen公司用lipofectamine2000替代了lipofectin，后者已经没有的买了。
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hold住[使用道具]
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 小中大

我在实验过程中觉得,LF2000的推荐比例比较高,若果我降低比例可以得到更高的效果,不知道各位也遇到这种情况,还是***作有问题.
我的DNA浓度1ug/ul左右,6孔板转染,2ugDNA,5ulLF2000 的时候效果更好一些,我转染的是MCF-7,最好也没有50%.
希望各位指教!
学习学习!
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jujuba[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位前辈，大家好！我看楼上有做小干扰RNA瞬时转染的，我也要做这个，我刚刚接触实验，很多问题都不明白，希望各位多多指教，我要转的是HepG2细胞，现在用的是含5%血清的1640培养基，我想问一下，转染时需要注意什么问题呢？还用这种培养基可以吗？我在前一天传代铺板第二天转染可以吗？另外，就是我转染后要做MTT分析时效和量效的关系，我是否可以直接用96孔板做转染就可以了？各位有没有相关的浓度梯度推荐给我啊？真的很迷茫，感激涕零！！！谢谢了！！
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