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标题:[求助]lipofectamine2000的转染率

DDD[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位前辈，大家好！我看好多用24孔板作转染的，一般做质粒转染也用24孔吗？我直接培养瓶可以吗？另外，我想做完转染先做MTT，是不是可以直接用96孔板转？还是先在培养瓶里转然后再种细胞按照MTT的步骤做啊？前辈们多给我一点建议吧，我实在很迷茫啊，谢谢了！
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831226[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我准备这几天作转染。有人说才复苏的细胞要传了三代后才转染比较好，因为传三代过后状态才比较好，请问是这样么？还有别人给我说细胞如果传了很多代了，会影响脂质体转进去的效率，因为在不断传代过程中，细胞膜结构可能改变，这种说法是否正确呢？
希望有经验的大侠指点下，谢谢
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发表于 2012-3-15 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位前辈，我想问问我要转染的是肝癌细胞株HepG2细胞，细胞密度达多少时转染最好啊？听说这种细胞株很难转，是这样吗？我刚接触实验，希望各位多帮帮忙！！！多谢了!!!
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发表于 2012-3-15 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问问各位，转染时加DNA或RNA时几微克是不是还需要换算阿？具体怎么算阿？听说还得用什么仪测,是这样吗？怎么算阿？有哪位好心人帮帮我啊？急需求助阿，谢谢！！！
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是在HepG2细胞的转染，听说这个细胞很不好转染，我师姐建议我用含有GFP标记的质粒转染，与目的质粒同时做，可以评价目的质粒的转染效率，然后再进行后面的实验。
1.转染没听说过用培养瓶做的，那样消耗脂质体太多了，脂质体1.5ml的就要3000多块，一个瓶里要加至少3 4ml培养基，你可以按比例算一下大约需要多少脂质体。
2.HepG2细胞长得比较慢，建议传代时密度稍微大一些，10000/孔（96孔板）应该算比较大了。第二天的时候细胞融合能到80%左右。我种板时用的不含双抗的含有胎牛血清的MEM培养基，到转染时把培养液吸去，先加入50ul不含血清不含双抗的MEM，然后加入用不含血清不含双抗的MEM稀释过的混合了质粒和脂质体的液体。6h左右后换液，加入含有10%胎牛血清和双抗的 MEM，继续培养。
3.不明白你的意思，“转染时加DNA或RNA时几微克是不是还需要换算阿？”你的质粒应该是浓度已知的比如**ug/ul，按照说明书的要求每孔加入**ug，那你就可以计算出你要加入的质粒有**ul。测定质粒弄得可以在紫外分光光度计上测定OD260，然后进行换算，应该是OD260*？？*稀释倍数=*ug/ml（？记不清了，RNA的应该是40）。
4.转染可以在96孔板中做，然后再做MTT就可以，转染不应该再培养瓶中做，太浪费了而且不能保证脂质体与质粒充分的作用于细胞。
祝你好运，我最近也在做，HepG2确实不好转，建议你先做一下预实验，然后摸索到好的条件在大批量的做MTT，我的惨痛教训，没做预实验直接进行下边的实验，一下做了40个孔，结果检测质粒根本没转进去，我的下边的试剂全都浪费了，将近80块钱呢。
我也正在摸条件，祝我们同样好运。
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发表于 2012-3-15 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有关转染很头疼的问题：
为什么转然后我的细胞几乎都死了，条件摸的是最佳的转染条件，并且质粒提的纯度在1.8以上，不知道是哪个环节出了问题！
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发表于 2012-3-15 13:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问下各位，我做预实验摸出了最佳的转染比例，但做正式试验时转染后48小时见液体变黄就换液了，今天早上一看细胞全死了，什么原因啊?难道换液对它刺激就死了吗？但是不换液也不行吧？为什么预实验挺好的正式实验就不行了呢？请各位前辈帮帮我吧！多谢了！
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发表于 2012-3-15 13:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于质粒的纯度: OD260/280 其实没什么,主要看你用什么方法纯化的,电泳后条带是否清晰,去盐了么?去酚了么?去内毒素了么?去RNA了没? 脂质体它是随机的将小分子包在内部,上述的各种杂志会严重影响脂质体:质粒复合物形成,并且有些还会对细胞有致命的毒性.
关于脂质体,invitriogen的各种产品说明上都有明确的比例介绍,一般是与质粒的量相比较而定,每种细胞对脂质体的毒性反应不同,所以对转染的时间,转染试剂的用量，细胞的铺板等,都有所要求.
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发表于 2012-3-15 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 我个人觉得转染不是很难，但是质粒的提取比较重要，一定要把一些杂质除去。
2.我个人转染过大概5ug， 10ug的质粒进入Hela，感觉都不错。
3.Lipo2000上面推荐的量个人感觉有点偏高，适当降低也可以做的很好。
4. 我用Hela，H1299做转染，293T转染效率道理上应该高些，但是因为293T处理起来很难，很容易漂起来，我一般不用。
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发表于 2012-3-15 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。

3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。

4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的！

5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。

6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高
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