细胞世界

最近尝试筛选shRNA的稳定细胞系遇到一些问题。

shRNA的表达载体携带puromycin的筛选标记和GFP，首先用瞬时转
染检测了一下抑制效率。转染48小时后，从GFP表达看，转染效率大约40%左右，提取RNA检测抑制效率发现转染携带对照shRNA的质粒(称为NS质
粒吧)不影响目的基因表达，而siRNA质粒（称为KD质粒）降低了表达约50%。

将未转染的细胞，转染NS质粒，转染KD质粒的细胞以
同样的密度接到6孔24孔板开始筛选。4天以后，未转染的细胞全部死亡，转染的细胞大多死亡，每孔大约有10~30个细胞活下来，基本都是GFP阳性。我
不倾向选单克隆细胞株，所以给要持续筛选，细胞开始慢慢增殖，GFP也开始逐渐减弱（重复了3次筛选过程，都是如此）。大约3个礼拜后，提取了RNA检测
是否有抑制作用。

每种转染的质粒我分别用6个孔进行了筛选，RT-PCR的时候用了未转染的细胞系做对照，问题是，即便在转染NS质粒的
细胞中，6个里面有5个目的基因表达都比未转染的要低很多（其实我还转染了空载体对照来筛选，结果相似6个里面有4个要低），转了KD质粒的6个细胞全部
低了。

我想知道其他人是否有过类似问题，如果没有类似问题，能帮我指出我的错误在哪里？如果有类似问题，选择哪个转染了NS质粒或者空载
体的质粒的细胞做对照？如果人为选择那个表达没降低的作为对照，怎么知道转染KD质粒的细胞中目的基因表达减少是因为shRNA的作用而不是筛选药物造成
的影响？（毕竟绝大多数对照也降低了）

谢谢！

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一般这种情况有以下几种可能：

1，使用了基因组不稳定的细胞系，经过药物筛选后，出现基因表达异常
2，目的基因干扰或者过表达，对细胞选择有优势或者压力，倒是筛选出来的细胞异常
3，NS质粒表达量过高，对照shRNA引起了general off targets效应

解决方式，一般使用rescue实验，以KD质粒为对照，过表达target site突变的质粒，如果表型能rescue，那么就说明KD表型是由KD质粒引起。

很抱歉，最近一直很忙，没有来dxy上和大家交流，我这里谈一些我自己粗浅的理解：

首先要理解假阳性有两类，一类是耐药但不表达目的基因的假阳性，一类是初次筛选得到大量克隆，但克隆后期无法生长且无目的基因表达的耐药和表达双假阳性克隆。这两类假阳性产生的原因不同，采取的策略也不同。

1，环形质粒和线性质粒得到耐药克隆株的概率是差不多的，但环形质粒随机整合，可能导致抗性片段插入而目的基因未得到整合，因此产生假阳性克隆的概率要大一些，不过这不是假阳性克隆的主要原因。这部分克隆就耐药来说，是真实的阳性，只是不表达目的基因罢了，属于第一类假阳性。

2，更多的是第二类假阳性克隆，主要来源于细胞密度和药物筛选浓度的不匹配。用于筛选稳定株的药物，多数是作用于代谢通路，而代谢通路对细胞的状态极其敏感，包括细胞之间的crosstalk，因此当使用不正确的细胞密度和药物浓度进行筛选，最容易得到假阳性，且这些假阳性如果重新按低密度铺盘，比如1/100，多数情况下无法生长，因此这些假阳性就耐药来说，也是假阳性。在实际操作中，这些克隆往往在6 well plates中恢复生长时，在筛选药物浓度下，无法扩增。

3，细胞在筛选过程中产生耐药性的概率非常低，耐药株筛选需要非常复杂的程序，不是一般的稳定株筛选能产生的。

4，假阳性克隆出现的概率还和筛选方法有关，如果是用克隆环法挑取，比如lz提到的2周后就挑选克隆，极有可能是这种办法，那么得到假阳性克隆的概率非常大，这种方法快速，但对筛选条件要求极高，需要丰富的经验去判断细胞密度和药物浓度的搭配使用。

5，针对4提到的问题，可以用96孔极限稀释法，将2周内得到的pool，置于96孔板中再次筛选，时间周期虽然很长，但一般可以得到比较多的阳性克隆。

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请教一个问题，我将目的基因通过IRES序列将Puro抗性基因进行连接，这样从原理上讲有puro抗性的细胞将都是有目的基因表达的克隆，可我在实际操作中发现并不是这样，有些抗性克隆并无目的基因表达。你所讲的细胞密度和药物筛选浓度的问题也都注意到了，因为对照细胞均能够在3天死亡。请问对这样的问题，您有何高见？期待您的解答。