小中大最近尝试筛选shRNA的稳定细胞系遇到一些问题。
shRNA的表达载体携带puromycin的筛选标记和GFP,首先用瞬时转
染检测了一下抑制效率。转染48小时后,从GFP表达看,转染效率大约40%左右,提取RNA检测抑制效率发现转染携带对照shRNA的质粒(称为NS质
粒吧)不影响目的基因表达,而siRNA质粒(称为KD质粒)降低了表达约50%。
将未转染的细胞,转染NS质粒,转染KD质粒的细胞以
同样的密度接到6孔24孔板开始筛选。4天以后,未转染的细胞全部死亡,转染的细胞大多死亡,每孔大约有10~30个细胞活下来,基本都是GFP阳性。我
不倾向选单克隆细胞株,所以给要持续筛选,细胞开始慢慢增殖,GFP也开始逐渐减弱(重复了3次筛选过程,都是如此)。大约3个礼拜后,提取了RNA检测
是否有抑制作用。
每种转染的质粒我分别用6个孔进行了筛选,RT-PCR的时候用了未转染的细胞系做对照,问题是,即便在转染NS质粒的
细胞中,6个里面有5个目的基因表达都比未转染的要低很多(其实我还转染了空载体对照来筛选,结果相似6个里面有4个要低),转了KD质粒的6个细胞全部
低了。
我想知道其他人是否有过类似问题,如果没有类似问题,能帮我指出我的错误在哪里?如果有类似问题,选择哪个转染了NS质粒或者空载
体的质粒的细胞做对照?如果人为选择那个表达没降低的作为对照,怎么知道转染KD质粒的细胞中目的基因表达减少是因为shRNA的作用而不是筛选药物造成
的影响?(毕竟绝大多数对照也降低了)