[求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因 - 经验共享

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因

35 3/4 ‹‹1 2 3 4 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2012-3-18 11:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般测出的OD值是多少比较合适的？有人说是要在0.2-0.8范围内是成线性关系，也有人说是在1.5到2多比较好，我也不是很明白，为什么差异会这么大，大家的结果都是什么样子的，哪个好些？

———————————————————————————

产生这种问题的原因在于不同的酶标仪的线性范围不同。

kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-3-18 11:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位，有点不明白你们在说什么。加入MTT一定时间后，MTT 在细胞培养体系中被活细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ，是一种紫黑色的结晶。在加入DMSO后Formazan被从细胞内溶解出来，从而通过测吸光度判断活细胞的含量，活细胞比例很大导致看起来很黑，这个现象在正常不过啦，为什么要说是污染了呢？

薄荷侠[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79372
精华 0
积分 186
帖子 112
信誉分 100
可用分 1311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

发表于 2012-3-18 11:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢各位的关注，今天又重复了实验，在加药物前先加MTT试一试（加MTT前细胞状态很好，没看到明显污染），结果大概30分钟可以看到培基颜色变黑，在镜下可以见到细胞内的黑色结晶和一些刺猬毛样黑色物质（不知道怎么形容，以一个点为中心成放射状撒开，部分和细胞有连接，吸取上清的时候明显可以带走部分部分这种结晶，贴壁不稳，可惜没带相机）。原来怀疑是MTT的原因，就马上借了实验室其他2个的MTT加进去结果一样，同时换用无血清的培基再加还是变黑。请实验室的几个做细胞的高手看了，也说不清到底是什么东西。现在只有细胞没换了，其他的基本都换了，难道真的重新复苏细胞在做吗？关键到底是什么原因啊。说污染确实细胞生长不受影响，黑胶虫也没怎么看到。唉，近来真的够衰的啦，刚开始做的时候还好好的，现在快一个月了还没做出来，老板催着要结果，快要崩溃了。

xevin[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76455
精华 0
积分 799
帖子 1176
信誉分 101
可用分 6807
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-3-18 11:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我一直不支持MTT这种方法,觉得它的可信度不高,灵敏度也不高,而且你说的这种情况很普遍,我知道如果污染了加入MTT后一般都会变黑的,但是是否有别的情况也会使其变黑,值得研究.建议楼主换别的方法试试!

wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态离线

发表于 2012-3-18 11:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也认为是由于活细胞数量过多所引起，也许药物对细胞的抑制能力差吧。我们做MTT时遇到多污染的现象，只是孔内液体变混浊，变污，而且与其他为污染孔相比较很容易分辨，甚至肉眼即可辨别，而且加DMSO也是在普通条件下加的，所以我想不是污染所致。可以试着增加药物浓度，或者稀释一下细胞数量，在试一下。期待你的下一次结果，祝你好运！

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2012-3-18 11:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚看见第一贴，反应就是污染了。污染后的细胞孔就是很容易变黑，而且吸上清时容易被吸出。
后来看了大家的讨论贴，感觉你能肯定没污染，那么有可能：
1、细胞内的黑色结晶和一些刺猬毛样黑色物质
这是MTT加入形成的显色的结晶物质，应该没问题。
2、黑色太多，
不知你的MTT浓度用的多少？
3、细胞密度
既然你都重复这么久了。再做一次吧。在同一板子中用不同密度种细胞，试试看，排除细胞密度问题。

orangecake[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77305
精华 0
积分 512
帖子 724
信誉分 100
可用分 4431
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2012-3-18 11:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谈点我的看法：
1)污染问题：我认为你的细胞没有污染，理由是你回帖中讲到你没有在复苏新的细胞，说明你仍然在用同一个细胞做试验并传代。在相同的培养条件下（如同一培养箱），传代细胞是正常的，那么你实验中细胞也可以确定来源是正常的。因此说不是细胞污染问题。
2)黑色颗粒：我以前看过镜下的甲臢，文献讲MTT还原后生成的甲臢为紫色，但我看到的实际上是紫黑色，更偏向于黑色。但我忘记了颗粒的形态，但析出的盐形成结晶是可能的。此外，你要说明一下，在加了溶解液或DMSO后，这个黑色是否溶解。如果溶解，我认为和正常MTT现象一致，因此我认为黑色颗粒是正常的。
3)OD值：由于我们作MTT时并没有吸取上清液，因此我不确定我们的具体实验结果是否能提供参考价值。但我们目前作的结果，肿瘤细胞48小时OD值基本在1.0－1.6。
4)阳性对照：你所提供的信息和讨论均未提到阳性对照，我不知道为什么，阳性对照的作用，一方面是让你进行对比，另一方面就是要证明你整个实验的完整性和正确性，而你现在没有阳性对照（也许我没看到），所以你问题出现后不能找出原因。
5)细胞密度：我认为问题出现在细胞密度上，有黑色颗粒析出，说明甲臢浓度高，量多了，析出了，其原因说明细胞还原酶多了（不考虑活性提高的可能），也就是说细胞量多了。遗憾的是你没有提供阳性对照，因此现在能判断的，只有你的细胞密度问题。

建议：1)设阳性对照2)降低细胞密度

zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2012-3-18 11:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上分析的很精细
也许是我没有看完所有帖子
我感觉细胞染菌可能性较大
（因为楼主说空白组没有变黑）
还有你的MTT溶液是自己配的吧
浓度是不是不合适？
和楼上说的一样
我也建议你做个阳性对比一下看看

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2012-3-18 11:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

肯定不是污染，降低MTT的浓度。另外，MTT的货号和你的配方说一下。

薄荷侠[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79372
精华 0
积分 186
帖子 112
信誉分 100
可用分 1311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

发表于 2012-3-18 12:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢大家的帮助。今天又重复了实验，结果还是变黑了。
1.大家所提到的“阳性对照组对照组”是否就是指只加细胞和培基不加药物组？每次这个组也变黑了。
2.细胞密度并不大，我种板用的密度是104，每孔100UL。
3.MTT用的是鼎国的，另外还用过碧云天的试剂盒，也用过sigma的，结果都一样，今天还特意现配的鼎国的MTT，加PBS溶解，过滤避光，浓度用的是5mg/ml,每孔加10UL，我还特意试了加5ul、2.5ul结果也一样。
4.每次细胞在96孔板第一天贴壁生长快，加药物干预后呈浓度依赖性可以看到明显的抑制作用（细胞数量不同），同时好象背景有点模糊，细胞间可以看到细颗粒样的东西，但细胞生长状态可。
5.今天加MTT后请实验室一师兄分析了下，他觉得可以看到辐射状分布的可能是菌丝，认为有可能是真菌污染，据他的经验真菌生长慢，不一定很明显影响细胞生长，但MTT是否能与真菌反应？真菌感染后细胞生长传代都不受影响吗？
6.打算重新复苏细胞，把所有东西都换了，看结果怎样。

35 3/4 ‹‹1 2 3 4 ››