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标题:[求助]请教树突状细胞的培养经验

tianmei001[使用道具]
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材料与方法
　　1. 病例选择：慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者组（CHB组）7例，男4例，女3例，年龄23～49岁，平均（35±13.6）岁，纳入标准：人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A*02阳性，丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotrans-ferase，ALT）>80U/L，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg）、抗-HBc均阳性（采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒为美国阿克苏公司产品），排除甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C viru，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染。急性乙型肝炎痊愈组（AHB组）4例，均为北京地坛医院住院患者，男女各2例，年龄21～44岁，平均（34.5±8.4）岁，纳入标准：HLA-A*02阳性，病程<3月, 发病期ALT>1000U/L，待ALT复常后3月，HBsAg阴转，抗-HBs阳转，HBeAg、抗-HBc均阴性，排除HAV、HCV、HDV、HEV感染。以上诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案[3]。健康志愿者组(HD组)6例，年龄26～36岁，平均（30±5.6）岁，纳入标准：HLA-A*02阳性，ALT<40U/L，乙型肝炎标志物均阴性，无其它免疫系统合并症。
　　2. 主要试剂及来源：重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子购自德国先灵葆雅公司（1.110U/mg），重组人肿瘤坏死因子-α、重组人白细胞介素-4购自英国Peprotech公司，淋巴细胞分离液（1.077g/ml）购自北京鼎国公司。红细胞裂解液购自美国Sigma公司。RPMI 1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。鼠抗人HLA-A*02单克隆抗体（BB7.2细胞株）由北京大学医学部陈慰峰教授惠赠，T2细胞由第四军医大学隋延仿教授惠赠。FITC结合鼠抗人CD8单克隆抗体、PE标记鼠抗人γ干扰素(interferon，IFN-γ）单克隆抗体购自美国B.D.公司。PE标记鼠抗人白细胞介素（interleukin，IL）-2、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)单克隆抗体、细胞内染色相关试剂如抑制细胞因子分泌试剂Golgistop(monensin)、破膜剂、洗液均购自美国Pharmingen公司，CTL特异性杀伤试剂盒购自美国Promega公司，FACS固定液购自美国B.D公司。
　　3. HLA-A*02型别鉴定：研究对象取200μl新鲜抗凝全血，每管100μl加入流式细胞仪检测管中，再加入2ml红细胞裂解液反应12min后离心，弃上清液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗细胞两次，其中反应管加入鼠抗人HLA-A*02抗体（BB7.2细胞株培养上清液）100μl, 4℃ 30min孵育后，PBS再次洗细胞，每管加入PE标记羊抗鼠Ig 2μl，4℃ 30min孵育后，PBS洗涤，FACS固定液200μl加入每管，4℃保存用于流式细胞仪检测。
　　4. 多肽合成：依据已知的肽序列合成HBV C区HLA-A*0201限制性CTL表位多肽HBcAg 18-27，序列为FLPSDFFPSV。多肽由赛百盛公司合成，经HPLC纯化后，纯度为大于90%，冻干粉末以2g/L浓度溶于二甲亚砜，-20℃保存备用。
　　5. 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 制备：取研究对象新鲜抗凝外周血，用RPMI 1640不完全培养基以1:1比例稀释，并缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上，经密度梯度离心后取白膜层细胞，不完全培养基洗细胞两次，调整细胞浓度，1×106/ml加入24孔板，每孔加入2ml AIM-V无血清培养基。
　　6. DC的培养：参照文献[4]。
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7. 特异的记忆性T细胞应答：用分离的PBMC（1×106/ml），加入HBcAg 18-27 20μg/ml，阴性对照仅加入同体积的DMSO，阳性对照加植物血凝素2μg/ml，37℃ 5% CO2孵育1h后每孔均加入Golgistop, 每毫升培养液加入0.7μl Golgistop (使其终浓度为0.2μmol/L), 继续培养5h，培养结束，收集细胞。然后进行细胞内细胞因子的染色实验。
　　8. HBV特异的T细胞免疫应答的诱导及检测：(1)HBV特异的CTL的诱导：DC培养至第9日收集后，调节细胞浓度为1×106/ml，加入HBcAg 18-27多肽终浓度为20μg/ml，37℃ 5% CO2孵育，同时设未加多肽对照，孵育6h后收集细胞，用PBS洗脱未结合的多肽，经放射线照射，剂量为30Gy。将培养DC时未贴壁的淋巴细胞复苏，2×106淋巴细胞/孔铺于6孔板，然后将多肽刺激并照射后的DC加入1×105/孔，IL-2 50U/ml，37℃ 5% CO2共同孵育10d，每隔5d加入多肽刺激的DC 1×105/孔，每隔3d半量换液，同时加入IL-2 50U/ml。10d后，诱导结束，部分培养孔中再次加入多肽刺激照射过的DC 1×105/孔，1h后加Golgistop (0.7μl/ml)，培养5h后收集细胞，以备细胞内细胞因子检测IFN-γ、IL-2、TNF-α，收集剩余培养孔中细胞用于LDH释放实验。(2)流式细胞仪检测细胞内细胞因子染色：参照文献[5，6]。(3)靶细胞的制备：培养的T2细胞中加入HBcAg 18-27多肽终浓度为20μg/ml，37℃ 5% CO2孵育，同时设未加多肽对照，孵育4h后收集细胞，用PBS洗脱未结合的多肽，调整细胞浓度2×105细胞/ml。(4)CTL特异性杀伤实验：按LDH释放实验试剂盒说明，效应细胞和靶细胞比例梯度设为30:1、10:1、3:1，混合培养于96孔U底板中（每个条件设3个复孔），同时设对照，37℃ 5% CO2共同孵育5h，培养结束后，96孔板离心250g, 4min, 将50μl上清液转入酶标板中，按说明书操作，酶标仪检测波长490nm的A值（代表LDH酶活性），根据公式计算相应效靶比下效应细胞杀伤靶细胞的能力。杀伤率（%）＝（实验孔A值-效应细胞自发释放A值-靶细胞自发释放A值）/（靶细胞最大释放A值- 靶细胞自发释放A值）×100。
　　9. 统计学方法：采用样本均数t检验。
结 果
　　1. 特异记忆性T细胞应答：AHB组患者对HBcAg 18-27 CTL表位多肽产生很强的记忆反应，而CHB组及HD组产生的细胞因子远低于AHB组,见表1。
　　2. DC诱导特异的CTL应答：见表2。
　　3. LDH释放实验检测DC诱导的CTL对靶细胞的杀伤作用：在CHB组患者，经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育的靶细胞比例为30:1、10:1、3:1时，其杀伤率分别为（57.0±20.3）%、（49.5±20.2）%、（21.8±12.9）%；经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于未加肽孵育的靶细胞杀伤比例为30:1、10:1、3:1时，其杀伤率分别为(30.4±10.0)%、(27.0±12.7)%、（13.7±3.2）%；未负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育的靶细胞杀伤比例为30:1、10:1、3:1时其杀伤率分别为(28.4±10.0)%、（24.0±10.0）%、(14.5±3.0)%, 经负荷多肽的DC诱导的T细胞对于加肽孵育靶细胞的杀伤均高于对照组。
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表1 不同人群T细胞对乙型肝炎核心抗原18-27的记忆应答 （%）
组别 　例数 　　　分泌细胞因子的细胞占CD8+细胞的百分数
　　　　　　　γ干扰素/CD8 　　白细胞介素-2/CD8 　　肿瘤坏死因子-α/CD8
　急性乙型肝炎痊愈组 4 　　4.26±2.49 　　4.80±2.23　　4.57±2.29
　慢性乙型肝炎组 　7 　　　0.18±0.14 　　0.13±0.05 　　0.37±0.18
　健康志愿者组　　 6 　　　0.28±0.13 　　0.59±0.27　　 0.68±0.33
　t值，P值* 　　　　　　　2.851，0.019 　2.709，0.024 　3.235，0.010
　t值，P值** 　　　　　　　2.999，0.013 　2.508，0.031 　3.305，0.010
* 为慢性乙型肝炎组与急性乙型肝炎痊愈组比较；** 为健康志原者组与急性乙型肝炎痊愈组比较，差异均有显著性
表2 慢性乙肝患者淋巴细胞对乙型肝炎核心抗原18-27多肽刺激树突状细胞诱导T细胞反应
组别 　　例数 　　分泌细胞因子的细胞占CD8+细胞的百分数（%）
　　　　　　　 γ干扰素/CD8 　　白细胞介素-2/CD8 　　　肿瘤坏死因子-α/CD8
慢性乙型肝炎组（1） 7 0.18±0.14 　0.13±0.05 　　　　　　0.37±0.18
慢性乙型肝炎组（2） 7 0.59±0.39　 0.74±0.16 　　　　　　1.52±0.38
慢性乙型肝炎组（3） 7 0.28±0.15　 0.46±0.13 　　　　　　0.68±0.15
t值，P值* 　　　　　 2.401，0.033 　2.383，0.035 　　　　2.769，0.017
t值，P值** 　　　　2.259，0.043　 2.191，0.049 　　　　　2.498，0.028
1为多肽刺激外周血单个核细胞组，2为经多肽刺激树突状细胞诱导T细胞组，3为未加多肽刺激树突状细胞与T细胞孵育组。* 为1组与2组比较；** 为3组与2组比较

讨 论
　　HBV感染机体后，体内的CTL通过杀伤靶细胞和分泌细胞因子的非细胞毒机制抑制病毒复制，因此抗病毒T细胞免疫反应的强弱，很可能成为决定急性自限性感染或慢性感染的标志。在急性感染最终清除病毒的个体中，其对于HBV的CTL反应是多克隆、多特异性的，而在慢性感染的个体，对于HBV的CTL反应很弱、几乎测不到，机体对HBV形成一种免疫耐受状态而成为慢性迁延不愈。
　　当致病原侵入机体时，体内的免疫系统产生较强的针对此抗原的免疫反应清除致病原，进入免疫反应的后期，多数效应T和B淋巴细胞逐渐凋亡，但是有部分淋巴细胞分化成为长寿命的记忆性细胞，再次遭遇抗原时，可以对抗原产生很强的次级免疫反应，通过杀伤感染的细胞和分泌细胞因子来消除致病原。根据表面标志及功能，分为CD4+和CD8+记忆性 T细胞[8]。实验发现CHB患者和健康志愿者的PBMC对于HBcAg 18-27 CTL表位多肽的刺激生成低水平的细胞因子，而AHB患者PBMC针对HBcAg 18-27 CTL表位多肽的刺激其T细胞可分泌较高水平的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α，与CHB患者比较差异有显著性。表明AHB患者对HBV有记忆性细胞存在，可以产生记忆性免疫反应，而CHB患者对于HBV仍处于免疫耐受状态。
在免疫系统中T细胞占有极其重要的地位，T细胞不仅有效应功能，而且是机体调节免疫功能的主体，在清除HBV中，辅助性T细胞（helper T cell，Th）和CTL都起着至关重要的作用，T细胞的活化需要两个信号：第一信号来自T细胞受体识别APC表面的主要组织相容性抗原-肽复合物；第二信号是由协同刺激分子相互作用提供的，包括CD28/B7等，这两组信号都有APC参与作用，DC是其中最强的抗原呈递细胞，其表面丰富表达主要组织相容性复合物分子、协同刺激分子B7和黏附分子，分泌IL-12，从而诱导初级免疫反应，活化初始型T细胞[9]。DC广泛的分布于全身各器官，可以从外周摄取抗原，将其处理后呈递给T细胞，诱导免疫反应，因此DC是免疫反应的启动者。HBV转基因小鼠不能对HBsAg产生免疫反应，但是当将DC回输给小鼠时，可以产生正常数量针对HBsAg的CTL，HBV转基因小鼠对HBsAg的耐受是由于T细胞无能或T细胞忽略形成的而不是由于T细胞的缺失[10]。DC给T细胞提供了活化必须的信号，因此产生了特异的CTL。将DC事先以HBV C区CTL表位多肽刺激，再将刺激后的DC与自身淋巴细胞孵育，诱导T细胞活化，实验结果显示诱导后的T细胞均可分泌较高水平的细胞因子，与其记忆性T细胞比较分泌细胞因子的水平有显著提高。
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不同T细胞亚群分泌的细胞因子也不同，IL-2、IFN-γ、TNF-α这3种细胞因子是Th1型细胞因子，而且活化的CTL也可以分泌。IL-2是T淋巴细胞主要的自分泌生长因子，同时也可刺激其它T细胞衍生细胞因子如IFN-γ的产生；IFN-γ与TNF-α的作用相似，可以抑制病毒复制，并且可以增加I类主要组织相容性抗原分子的表达，以此促进CTL介导的病毒感染细胞的杀伤[9]，因此在实验中选择了检测上述3种细胞因子。从实验结果显示经免疫表位多肽诱导的CHB患者DC可以在体外诱导特异性效应T细胞活化，并分泌对病毒清除有重要作用的细胞因子。因此理论上，可以将这种经诱导的DC回输至患者体内，可以有望打破机体免疫耐受，清除体内的HBV。
参 考 文 献
　　1Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, 392: 245-252.
　　2Nouri-Shirazi M, Banchereau J, Fay J, et al. Dendritic cell based tumor vaccines. Immunol Lett, 2000, 74: 5-10.
　　3中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防止方案. 中华肝脏病杂志，2000, 8: 324-329.
　　4李若冰，陈红松，费然，等. 慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究. 中华医学杂志，2002，82：887-890.
　　5Waldrop SL, Pitcher CJ, Peterson DM, et al. Determination of antigen-specific memory/effector CD4+ T cell frequencies by flow cytometry: evidence for a novel, antigen-specific homeostatic mechanism in HIV-associated immunodeficiency. J Clin Invest, 1997, 99: 1739-1750.
　　6Jung T, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods, 1993, 159: 197-207.
　　7姚桢. 分子乙型肝炎病毒相关病学. 北京：中国医药科技出版社，1997. 106-116.
　　8Ahmed R, Gray D. Immunological memory and protective immunity: understanding their relation. Science, 1996, 272: 54-60.
　　9Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirememts for CD4(+) and CD8 T (+)cell responses. Curr Opin in Immunol, 2000, 12: 448-455.
10Shimizu Y, Guidotti L G, Fowler P, et al. Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis B virus transgeneic mice. J Immunol, 1998, 161: 4520- 4529.
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AIM-V是无血清培养基 它的应用如下：
BIOMANUFACTURING BULLETIN
适应无血清细胞培养
论文：无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的生长和抗体产生
论文：用限定化学成分培养基培养CHO细胞生产重组蛋白
GlutaMAX™——最小化有毒性氨的产生
新型高级颗粒化技术培养基础（Advanced Granulation Technology™）
哺乳动物细胞和昆虫细胞
新型的FreeStyle™ 293表达系统
无酚红培养基
重组蛋白酶（rProtease）
高级D-MEM和高级MEM
第三章 无血清和无蛋白培养基

一个成功的企业，必定具备高瞻远瞩的战略眼光。在血清产品受到广泛欢迎，稳居市场占有率第一的情况下，GIBCO 即开始研制无血清培养基产品，这是基于对人类和动物保健品安全性的长远考虑。由于占据了市场先机，GIBCO 理所当然地成为无血清培养基生产的领先者。针对各种细胞如CHO细胞、淋巴细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞等的无血清培养基相继问世，并且发展了完全不含蛋白质成分的无蛋白培养基。而被称作Chemical Defined(化学限定的)的无动物来源培养基的问世，则标志着细胞培养基发展的至高境界。这种明确每一种化学成分、无任何动物来源组分的培养基，消除了对培养基生物安全性的任何担忧。

无血清培养基及应用

无血清培养基是设计用来在无血清条件下生长特殊类型的细胞或进行专门应用的培养基。无血清培养基的使用体现了一种重要的工具，它允许细胞培养在一套限定的条件下进行，尽可能免于干扰参数的影响。
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使用无血清培养基的优点 ● 增加确定性
● 性能更加一致
● 容易进行纯化和下游加工
● 细胞功能的精确评估
● 增强生长和/或产量
● 生理反应性的较好对照
● 增强细胞内中介物的检测


某些应用可能需要添加生长因子和/或细胞因子。

小 结：

无血清培养基——培养基中没有添加血清，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。

无蛋白培养基——培养基中没有添加蛋白，但是仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（例如，提供低分子量肽的各种水解物）

化学限定培养基——培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分。所有的成分均有已知的化学结构。

血液和骨髓细胞
血液和骨髓细胞 无血清培养基 产品目录号 价 格 应 用
淋巴细胞 AIM V® 12055091 查 询 补充IL-2的细胞毒淋巴细胞的间接体内 (Ex vivo) 激活。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞）或细胞毒T细胞的生长。
HIV病毒的生产。
12055083 查 询
31035025 查 询
0870112DK 查 询
0870112BK 查 询
巨噬细胞，单核细胞 Macrophage-SFM 12065074 查 询 生长和维持（可能有必要加入GM-CSF）。
证明巨噬细胞的噬菌作用。
使用γ干扰素或脂多糖激活能杀死肿瘤的细胞。
来源于骨髓、外周血和新生儿脐带学的人造血祖细胞（CD34+） Stempro® -34　SFM（补充Stempro® -营养添加物） 10639011 查 询 生长和维持人造血祖细胞（加入必须因子）。
研究生长因子在细胞分化时协同/独立作用。
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杂交瘤细胞
杂交瘤细胞 无血清培养基 产品目录号 价 格 应 用
小鼠，人，大鼠杂交瘤 CD Hybridomas Medium
CD Hybridomas AGT™ 11279023 查 询
化学成分限定，无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。

12372025 查 询
12372017 查 询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 Hybridomas SFM 12045084 查 询 低蛋白(20µg/ml)培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。
12045076 查 询
小鼠，人，大鼠杂交瘤 PFHM-II 12040077 查 询 无蛋白培养基，用于细胞生长和单克隆抗体生产。
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昆虫细胞
昆虫细胞 无血清培养基 产品目录号 价 格 应 用
Drosophila
melanogaster 细胞
(D. Me 1-2, Schneider S2 细胞)
Drosophila-SFM 10797017 查 询 无蛋白生长和维持培养基，用于贴壁或悬浮培养。
10797025 查 询
BTI-TN-5B1-4 昆虫细胞 Express Five® SFM 10486025 查 询 无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）细胞的生长和维持。大规模生产BEVS 表达重组蛋白。
Sf9,Sf21,TN368 细胞 Sf-900 SFM 10902096 查 询 无蛋白培养基，用于进行贴壁或悬浮培养的，使用BEVS细胞的生长和维持。
大规模生产BEVS 表达重组蛋白。

10902088 查 询
10902104 查 询
10902070 查 询
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人胚胎肾（293）细胞
293 细胞 无血清培养基 产品目录号 价 格 应 用
293 细胞（包括293-F,293-H） CD 293 Medium
CD 293 AGT™
11913019 查 询 化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒生产。没有动物来源成分。
12529020 查 询
12529012 查 询
293细胞，HeLa S3 细胞 293 SFM Ⅱ 11686029 查 询 低蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产或腺病毒的生产。没有人或动物来源成分的。
悬浮培养状态的293-F细胞 Freestyle™ 293 Expression Medium 12338018 查 询 无血清和无蛋白（＜10µg/ml）培养基，用于悬浮培养的293-F细胞的生长和转染。
12338026 查 询
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中华仓鼠卵巢（CHO）细胞
CHO细胞 无血清培养基 产品目录号 价 格 应 用
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CD CHO Medium
CD CHO AGT™
10743011 查 询 化学限定的无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。没有动物来源成分。
10743029 查 询
12490017 查 询
12490025 查 询
CHO细胞（包括CHO-S细胞） CHO-SFM Ⅱ 12052114 查 询 低蛋白（＜75µg/ml）培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。
12052098 查 询
31033020 查 询
22052047 查 询
CHO细胞 CHO Ⅲ PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO Ⅲ A PFM 无蛋白培养基，用于悬浮培养的细胞的生长和重组蛋白的生产的。可获得定制配方培养基。
CHO细胞 CHO-A-SFM 低蛋白（＜250µg/ml）培养基，用于贴壁培养的细胞的生长和重组蛋白的生产。可获得定制配方培养基。
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