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标题:【求助】血液中提取总RNA

盼盼[使用道具]
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【求助】血液中提取总RNA

论坛里有没有前辈用红细胞裂解液来提白细胞的。之前有处理过一批人骨髓的标本,用红细胞裂解液提的白细胞后,加入1000UL TRIZOL ,放入-80℃保存。积累了一批标本之后整体提RNA,逆转录,电泳。最后做的PCR,可是PCR出来的结果一直很不理想。
想请教前辈,用裂红提取白细胞这一个过程是需要无酶操作的吗?还没加TRIZOL裂解白细胞之前,细胞里面的RNA会被降解吗?网上有查到一站式提取血液中总RNA的试剂盒,不知有没有前辈用过,这种方法成熟吗?有没有资料可以比较一下这些方法提出的RNA的质量?能不能给点意见,我们有没有必要换一种提RNA的方法呢?
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盼盼[使用道具]
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还有很多战友提到的淋巴细胞分离液是怎么用的呢?跟红细胞裂解液有什么差别?
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831226[使用道具]
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RNA会降解的,尤其是血液取样的时候杂质较多,需注意无酶操作
试剂盒只是使用方便,效果未必比试剂好
低温保存的样本仍有降解可能,尤其是反复解冻
建议提出来后跑跑rna,看看条带怎么样,这样可以排除逆转录出问题的可能性
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wawa[使用道具]
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分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响,因为细胞内本身有大量内源RNase,只要细胞未破裂,外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞,这就激活了内源RNase造成降解,另外分离白细胞过程也会导致某些基因mRNA丰度发生变化,因为这个过程已经不是生理状态了。
我们公司有血液RNA提取的Kit(目录号RK206),全血(不是白细胞)直接加入2.5倍试剂,室温放置2小时,这个过程缓慢裂解所有细胞(包括白细胞),试剂中含阳离子多聚物能屏蔽DNA和RNA的负电荷,使DNA和RNA析出,与RNase隔离。每毫升血液产量约3-8ug RNA。如果不立即提取RNA,可以室温放置24小时,4度放置1周,-20度长期保存。
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盼盼[使用道具]
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原帖由 831226 于 2016-4-8 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

RNA会降解的,尤其是血液取样的时候杂质较多,需注意无酶操作
试剂盒只是使用方便,效果未必比试剂好
低温保存的样本仍有降解可能,尤其是反复解冻
建议提出来后跑跑rna,看看条带怎么样,这样可以排除逆转录出问题的可能性 ...

您的意思是在提取出RNA之后可以跑一跑胶,看看条带吗?我们实验室的师姐之前做的时候都是在逆转录出cDNA之后跑的胶。这样子有什么差别呢?
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QUOTE:
原帖由 wawa 于 2016-4-8 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响,因为细胞内本身有大量内源RNase,只要细胞未破裂,外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞,这就激活了内源RNase造成降解,另外分离白细胞过程也会导 ...

有没有文献提供,可以比对一下你们的试剂跟传统的全血中提RNA方法的效果?跟传统全血提RNA方法相比,你们试剂的优势主要体现在哪些方面?
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=菓子=[使用道具]
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外界环境中有许多RNA酶,血液中更多,所以您必须先检查您RNA的效果,只要看1,是否有拖带,2,看条带是否清晰。然后在反转,不然好可惜
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ns5fan[使用道具]
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直接跑RNA,这样可以观察到RNA的质量,然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力
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laughing妹[使用道具]
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1 不建议跑电泳,即使电泳了,也未必看到得到,因为全血提取的RNA量很少,替代方法,可以试用RT-PCR验证
2 红细胞裂解液中的成分会影响得率
3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试
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盼盼[使用道具]
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直接跑RNA,这样可以观察到RNA的质量,然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力

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我跟师姐说过,想要先跑一下RNA,看看RNA质量怎么样,再决定是否逆转录。但是因为我们做的是临床上病人骨穿后取的骨髓血,病人的标本都是很珍贵的,所以师姐建议我要跑RNA可以拿养的细胞来跑。师姐说如果细胞的RNA跑出来结果是好的,就可以了。但我觉得每个病人是不一样的,而且骨穿的标本是临床上给的,我们实验组的人,并没有在临床上,所以拿到标本的时候,一般都是骨穿过了好几天之后了的。虽然我们提RNA用的是相同的方法,但提出来的RNA的质量,对每个病人而言,都是不完全一样的。
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