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标题:[求助]求HUVEC细胞培养高手指导！

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发表于 2012-4-13 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]求HUVEC细胞培养高手指导！



2月份从sciencell购买的HUVEC，传了两代冻存了。3月份开始用冻了两代的细胞复苏，复苏生长的很好，4天就长满了。可是每次一传代就出问题：传代后第二天看的时候，板上有一些小黑点，贴在板上的，洗也洗不掉，消化也消化不掉。由于这些小黑点，细胞就不长了，第三天去看的话细胞就慢慢死了，培养基也变的不干净了。
也许有人要问，细胞是不是被污染了。我做了一个实验的，把这些死了细胞的培养瓶继续培养，液体不变浑浊，培养基颜色也还是ph7左右的样子。
分析了很多原因，不知道是不是消化的问题，还是细胞衰老的问题。可问题是细胞才传3代，而且复苏也没有问题。所有的东西都消毒了才用的。
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发表于 2012-4-13 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原因太多，不1定9跟细胞品种有关系。你还同时有养其他细胞吗？注意下操作过程的每1步，有的时候可能自己认为正确没有问题的操作，往往是出问题的关键。特别是用培养其他细胞的操作经验，来处理所有细胞，要注意普遍性与特殊性。
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发表于 2012-4-13 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也养着这种细胞 发张图片看看状态如何？
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发表于 2012-4-13 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前几天看见别人的HUVEC和我的不像 大家看看我的细胞怎么样？


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2012-4-13 16:47
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发表于 2012-4-13 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前几天看见别人的HUVEC和我的不像 大家看看我的细胞怎么样？

————————————————

从形态上看，状态没问题。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-4-13 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养的细胞形态和你的差不多，状态也不是很好
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发表于 2012-4-13 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家的明胶从哪里买的？明胶的质量有什么要求？化学纯行吗？
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3648755[使用道具]
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发表于 2012-4-13 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
血清有问题吗？试试不灭活的血清
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-4-13 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也一直 在养这个细胞，不过我是自己取的原代。就我的经验而言，我认为选择合适的培养液是很重要的，我一直都用ECM培养液，专门培养内皮细胞的，虽然贵了点但是效果还是很好的。消化时我用的是0.25%胰酶+0.02%的EDTA。培养瓶很重要，这种细胞很喜欢CO2，所以最好选用带滤膜的培养瓶,corning的比较好，也不需要自己铺明胶处理。其它好像跟养其它细胞没什么区别，一般都能传到7代左右不会有什么问题。楼主的问题我倒从来没碰到过，可能还是污染，才传3代细胞不会衰老的那么快的，仔细检查所用的试剂，移液管等，也可以试着用培养瓶养养看。
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发表于 2012-4-13 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在两年前养过HUVEC，不算高手。其中遇到过一些问题，但没有见过楼主这样的。我认为至少应该从以下几个方面考虑：
1.细胞的状态没有马上变差，而是逐渐变化，可见不是简单的细菌、真菌污染的问题，但既然有这种变化，应该是有污染的可能性，可能的污染有支原体、衣原体和黑胶虫等。看楼主给出的图中细胞状态不错，只是呈现出斑块状缺失，很像是细胞破碎。我们这里出现过黑胶虫，这种小黑点一样的东西是可以在局部范围内移动的，而且最开始不会影响细胞状态，长多了培养基变浑浊，细胞死亡。值得一提的是这三种污染都不能独立存在，必须有细胞参与，所以楼主继续培养的无菌实验不能排除这三种的可能性。我个人感觉HUVEC既然是取原代细胞，很有可能会带有这样的污染，尤其是像衣原体和黑胶虫这样在细胞内寄生的污染。
2.关于预先铺的基质，我们实验室使用的是大鼠尾一型胶原，millipore的，其实用量很小，效果很好，计算一下也不贵，可以长期保存，工作液也重复使用一个月左右。不过即使不铺任何基质，细胞还是能长起来，只不过状态不够好，有拉丝现象。
3.楼主最好能够确定下来这种黑点是不是悬浮的，如果连悬浮的都不是，我就不知道了，唯一一次见到的这种奇怪的贴壁黑点是红细胞碎片，几次传代后就没有了。
4.楼主的培养基成分怎样？注意血清要高，最好20%FBS，里面还得加入FGF及其稳定剂肝素，没有这种东西单靠培养基细胞肯定长着长着就死了。
5.HUVEC的冻存是一个很讲究的过程，建议先在4度再到负二十最后是负80而后液氮，必须慢慢来，复苏也不建议猛折腾它，如果能先贴壁后换液去除DMSO最好。
6.HUVEC的传代代数是有限的，你要确定细胞不老，最好是自己分原代细胞做6代以内。
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