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标题:【求助】如何确定二硫键是否形成

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-1-14 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，谢谢楼上各位高手指点！恩，跑个native 胶还是个不错的方法呵！

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如果是两亚基之间的二硫键，跑个native胶还行，如果同一条肽链上的二硫键，native胶行得通吗？
同一条肽链上的二硫键鉴定：生化书上介绍的是对角线电泳，楼上的战友说看其空间结构也行，对这一块不太熟悉，结构生物学有学，感觉挺高深的呵。
如果只有一个二硫键，加氧化剂就行了，多个可能会出现巯基之间的错误搭配。
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-1-14 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果想要形成二硫键，可以蛋白溶液换成氧化型的buffer，如GSH/GSSG溶液搅拌1个小时；或者NH4HCO3溶液，室温搅拌过夜，此法为自然氧化。
检测方面提供几种我想到的方法：
1.质谱。适用与分子量较小的蛋白
2.HPLC。二硫键形成后蛋白的保留时间会变化
3.CD谱。
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151****2614[使用道具]
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发表于 2023-1-31 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何确定蛋白中二硫键是否形成

各位老师好，我是个新手小白，我想知道如何确定蛋白中二硫键是否形成，请问有什么方法么，刚才查看帖子，跑native胶也可以，那native胶和SDS-PAGE胶的结果对比有什么区别么？
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151****2614[使用道具]
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发表于 2023-1-31 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何确定蛋白中二硫键是否形成

各位老师好，我是个新手小白，我想知道如何确定蛋白中二硫键是否形成，请问有什么方法么，刚才查看帖子，跑native胶也可以，那native胶和SDS-PAGE胶的结果对比有什么区别么？
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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-7-7 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要使蛋白质中的二硫键形成并检测到其存在，可以考虑以下方法：

提供适当的还原环境：二硫键的形成通常需要还原条件。可以在表达和纯化过程中添加还原剂，例如二巯基乙醇（DTE）或二巯基丙醇（DTT），以提供适当的还原环境。将还原剂添加到蛋白质表达系统（例如细胞培养基）中或在纯化过程中加入还原剂，以促进二硫键的形成。

优化氧化条件：在纯化过程中，可以使用适当的氧化剂来促进二硫键的形成。例如，可以添加氧化剂如氧化谷胱甘肽（GSSG）或氧化二巯基巴比妥酸（DTNB），以促使蛋白质中的巯基形成二硫键。

应用还原和非还原条件下的电泳：可以使用还原性电泳和非还原性电泳技术来检测蛋白质中的二硫键。还原性电泳在含有还原剂的条件下进行，可以断裂二硫键，使蛋白质以单体形式迁移。非还原性电泳则保持二硫键的形成，蛋白质以聚合物形式迁移。通过对比两种电泳条件下的蛋白质迁移方式，可以判断是否形成了二硫键。

使用生物学检测方法：可以利用二硫键特异性的还原酶，例如二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI），来检测二硫键的形成。PDI可以识别和催化蛋白质中的二硫键，从而帮助确认二硫键的存在。

请注意，二硫键的形成受到多种因素的影响，包括蛋白质的结构、氧化还原环境、温度等。因此，具体的条件和方法可能需要进行优化和调整，以获得最佳的二硫键形成和检测结果。
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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-8-8 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
确定蛋白质中是否形成了二硫键，以及如何促使二硫键形成，需要一些实验操作和技术。以下是一些可能的步骤和方法：

1. 促进二硫键形成：

   * 还原条件： 通常，蛋白质二硫键形成的过程是在还原环境下，如还原剂DTT（二硫苏糖醇）或β-巯基乙醇等的存在下进行的。你可以将已表达的蛋白在含有还原剂的缓冲液中进行再折叠和再氧化。

   * 缓冲液的选择： 使用适当的缓冲液和pH条件也可以有助于二硫键的形成。

2. 检测二硫键的形成：

   * 还原性SDS-PAGE： 这是一种常用的方法，通过将样品在还原条件下进行SDS-PAGE，然后与在非还原条件下进行的样品进行对比。在还原条件下，二硫键被断开，蛋白质会以解链的形式出现，而在非还原条件下，蛋白质会形成较大的复合物。

   * 西方印迹（Western Blot）： 类似于还原性SDS-PAGE，你可以将样品在还原和非还原条件下进行电泳，然后使用适当的抗体来检测蛋白质的状态。

   * 质谱分析： 质谱分析可以帮助确定蛋白质中二硫键的存在与否。通过质谱分析，你可以检测到蛋白质中的二硫键断裂产物，从而确定二硫键的形成。

   * 环己二烯（Ellman's Assay）： 这是一种检测游离巯基的方法，可以用来评估蛋白质中二硫键的形成。环己二烯试剂与游离巯基反应产生颜色变化。

   * 巯基化试剂： 使用带有巯基化试剂的技术可以在蛋白质中特异性地标记巯基，从而帮助检测二硫键的形成。

需要注意的是，不同蛋白质的折叠和二硫键形成过程可能存在差异，因此可能需要对实验步骤进行优化。此外，确保在实验过程中使用合适的实验室安全操作，并根据需要咨询同事、导师或专业技术支持，以确保获得准确的结果。
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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-8-18 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
确定蛋白质中是否形成了二硫键是蛋白质结构和功能研究中的一个重要问题。以下是一些常用的方法来确定蛋白质中是否形成了二硫键以及如何检测已经形成的二硫键：

1. 还原和氧化条件： 通常，二硫键的形成和断裂可以通过还原和氧化条件来控制。对于包含潜在二硫键的蛋白质，可以在还原条件下（如DTT或β-巯基乙醇）断裂已有的二硫键，然后在氧化条件下（如空气暴露或氧化剂，如氧化性亚铁氰化钾）促使新的二硫键形成。

2. SDS-PAGE迁移模式： SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是常用于分离蛋白质的方法。形成二硫键的蛋白质通常会显示出不同的迁移模式，因为二硫键的存在会影响蛋白质的线性结构，从而影响电荷密度和凝胶迁移速度。在还原条件下迁移的蛋白质可能会显示出更快的迁移率。

3. 非还原性SDS-PAGE： 这是一种用于检测形成二硫键的蛋白质的方法。在非还原性SDS-PAGE条件下，样品不会添加还原剂，这样形成的二硫键会在电泳过程中保持稳定。因此，蛋白质在凝胶上的迁移位置会更加接近其天然状态。

4. 质谱分析： 质谱分析可以提供蛋白质的分子质量信息，包括可能的二硫键形成。质谱分析可以用于检测蛋白质的还原和氧化状态，并确定二硫键的存在。

5. X射线晶体学： 如果蛋白质可以晶体化，X射线晶体学是一种非常强大的方法，可以直接观察蛋白质结构，包括二硫键的形成情况。

6. 二硫键还原剂和还原剂敏感性： 一些二硫键还原剂（如二巯基丙磺酸）可以帮助还原并断裂二硫键，然后你可以通过比较蛋白质在存在和不存在还原剂的情况下的结构变化来判断是否形成了二硫键。

总之，确定蛋白质中是否形成了二硫键通常需要一系列的实验方法和分析，涵盖了结构、电泳和质谱等方面。根据你的研究目的和可用的实验条件，你可以选择适合的方法或结合多种方法来进行分析。
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