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标题:[总结帖]细胞版疑难帖

qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我要做红细胞的CONFOCAL，用兀二醛固定效果非常的好，红细胞也不溶血，但是兀二醛有自发荧光，影响实验结果。所以请教各位大侠，有没有人做红细胞confocal，而且固定效果比较好的？谢谢了。
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2012-8-30 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我要做红细胞的CONFOCAL，用兀二醛固定效果非常的好，红细胞也不溶血，但是兀二醛有自发荧光，影响实验结果。所以请教各位大侠，有没有人做红细胞confocal，而且固定效果比较好的？谢谢了。 ...

对红细胞进行轻微的固定？使得MCV不变
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转然的是一种原虫，然后放到细胞里体外培养，没有内参，请问如何计算转染效率呢？
大家指点一下！
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发表于 2012-8-30 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转然的是一种原虫，然后放到细胞里体外培养，没有内参，请问如何计算转染效率呢？
大家指点一下！
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问有人做细胞机械牵张实验的吗？牵张装置在哪买，国外有家公司flexcell在国内的代理商有谁知道联系方式吗?
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做细胞诱导分化试验的，哪位高人能给我提供一下关于B-巯基乙醇和全反式维甲酸的诱导分化机理，如果有新的进展那就更好了，在下将不胜感激，谢谢！！
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用PEG介导的动物细胞融合技术实验时，为什么经常选择用鸡的红细胞？
还有怎么鉴别融合细胞与重叠的鸡红细胞呀？
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zzzz[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用8－mop和uva合用诱导成纤维细胞衰老，可是药物剂量已经到了300ng/ml在超净台里照射的uva，uva灯管是从正规厂家进的，uva输出波长是365nm，分别照射了10、15、30、45、60分钟，（文献上只是照射4－6min）我的竟然没有衰老！真是不可思议！还有药物剂量也已经是有关文献的几倍了！我的天哪，救救我吧！我的药是sigma的，应该不会有问题吧，有做过相关东东的朋友请帮我出出主意吧！
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-8-30 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求包含sv40大T抗原的表达质粒，主要用于真核细胞永生，万望大家帮忙，急呀：）谢谢！
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发表于 2012-8-30 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好.我现在用TUNEL法做病理科存档的石蜡标本切片来检测细胞凋亡.结果出现一个想不到的问题:出现几乎90%的细胞染成棕黄色,从形态学来看绝对不是凋亡细胞,不知道是什么环节出现问题 ,现请大家讨论一下,希望得到一些线索.我的实验步骤如下试剂盒为Promega 的TUNEL试剂盒)
1 烤片 60℃ 10分钟 , 切片厚5微米 为人正常小肠的组织
2 二甲苯脱蜡 10分钟*3次; 酒精水化 100% 5分钟*2, 90% 5分钟 ,80% 5分钟
3 蒸馏水 5分钟;PBS 5分钟*2
4蛋白酶K 20微克/ml ,15分钟,( 5分钟也做过) PBS5分钟*3 然后加3%H2O2 10分钟 . PBS 5分钟*3
5平衡液 5分钟
6混合反应液 37℃ 1.5h ,
7 SSC 终止液15分钟
8 PBS 5分钟*3
9 HRP 30分钟
10 PBS 5分钟*3
11 DAB 30秒 蒸馏水清洗
12 苏木素 复染
13 泛滥
结果 :90%的细胞核染成棕黄色, 但无背景染色,形态学不像凋亡细胞.
原因:1 可能为蛋白酶K 的问题吗? 说明书提到是10~30min ,时间过长是不是阳性率更高?但孵育 5分钟做出来的结果跟10分钟的一样
2 是不是混合反应液的浓度太高? 但我是按说明书配的,
3 反应时间太长? 但说明书提到混合反应液可以反应1~2h
4 DNA 酶的污染 ? 可能性很小 因为别人都在同样的条件下 都可以出结果
5 组织在固定的时候引起DNA的断裂?
6 DAB 的浓度太高? 但背景染色不深
7 假如用微波处理,其作用是什么?能否降低假阳性
8 配反应混合液的时候顺序有问题?我是先加平衡液98微升,然后加 rTDT酶及标记物各1微升
请大家多多指导 谢谢
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