蛋白质与蛋白组学

甲醇用20%
再加0.01%的SDS
可以用300mA 1h
转膜时注意降温

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谢谢老师的指导！昨天按老师说的做了，只是电流没敢加那么多，用了250ma 1H，一张膜用的标签抗，做出来了。另一张膜是用自己纯化的血清抗，可是没有条带，背景倒是比较干净，请问老师该如何改进呢？

还有一个问题：28KD的蛋白转300MA，1H不会转透吗？如何根据分子量大小选择湿转转膜时间和电流？原则是什么？

我有一蛋白抗体识别的分别是80KD和50KD的片段，那么做western时需要两个都做出来吗？发文章时之用一个片段能说明问题吗？不然两个片段在一张膜上相差挺远的呢，谢谢啊！

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1，看相关文献
2，减少跑电泳时间就可以让80K与50K距离离得近些

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可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer,老师您说的这个是一块胶上的。
我的意思是一块胶上3个样本，另一块2个样本，该怎么加？
关于空白孔的上样缓冲液我一把是2X LOADING BUFFER加等体积的溴芬兰，不知道有没有问题？
麻烦老师了，新人问题比较多

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呵呵
都是从新人过来的
buffer处上一倍的loading
good luck

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谢谢老师 前面的回答。PVDF膜通常用甲醇活化，可不可以用乙醇或其他试剂代替。转膜缓冲液中的甲醇可不可以用其他试剂代替？

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不可以
像Millipore的PVDF只能用无水甲醇活化
转缓中的甲醇也不能由其他试剂代替

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心肌梗死

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谢谢老师的指导！昨天按老师说的做了，只是电流没敢加那么多，用了250ma 1H，一张膜用的标签抗，做出来了。另一张膜是用自己纯化的血清抗，可是没有条带，背景倒是比较干净，请问老师该如何改进呢？

还有一个问题：28KD的蛋白转300MA，1H不会转透吗？如何根据分子量大小选择湿转转膜时间和电流？原则是什么？

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1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定 恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

老师你好，我前面咨询过您eNOS WB的问题，上次不能看到二聚体的原因是一抗的问题。现在换了新的合适的一抗，还是有问题曝光后不能看到条带，在实验过程中，我发现，在转膜后彩虹MARKER的量很多，随意封闭，洗膜，一抗，二抗孵育，彩虹MARKER的颜色越来越淡，不知道是什么原因，我有个疑问 在该过程中目的蛋白会不会也在减少？怎么避免这个问题？
我有的封闭液为TBS-T(0.1%Tween 20)+5%脱脂奶粉，RT 1 H，此后有TBS-T(0.1%Tween 20)洗脱10min 3次，再用TBS-T(0.1%Tween 20)＋一抗（1：800）孵育。再洗脱3次，用TBS-T(0.1%Tween 20)＋二抗（1：2000）孵育2H，曝光15分钟，结果是背景很干净，不能看到任何条带。

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1，Marker变浅是因为蛋白中结合的染料被洗掉了，长时间浸泡在液体中、不同的pH都会有影响。避免不太可能，除非Marker质量很好
2，加大上样量，同时抗体浓度加大
抗体是哪个厂家的？把抗体的链接挂上来

我跑了两次WB，DAB显色后结果都是这样？你帮我简单分析一下吗？谢谢！我的目的蛋白应该就是红色marker对应的位置。

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说的太简单了
做的什么蛋白等等信息一点都没有啊
1，二抗浓度有点高，加大稀释度至少两倍
2，一抗的稀释度要多试几个