【求助】转完膜后PVDF膜是直接放到抗体内还是用PBST洗几遍？

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• gogo (2014-1-24 22:28:31)

  楼主可能在程序上稍有些混，
  转膜完毕后应先进行封闭，用5%的脱脂牛奶即可，一般1小时即可，
  然后才是加一抗，一抗孵育好之后，下一步就是一抗的洗脱，即洗脱非特异性结合的一抗，我们是用TBST洗3次，每次10分钟。如果抗体的特异性不好，可以适当加多洗脱次数，洗1小时也可。
  在所有这些过程中，PVDF膜应保持湿润，但不存在转膜后洗膜的问题，希望对楼主有所帮助。

• daod (2014-1-24 22:29:41)

  
  封闭
  也可以不封闭
  封闭是为了封闭膜上的蛋白吸附位置
  这样抗体才特异的结合到目的蛋白上

• xue258 (2014-1-24 22:30:05)

  
  恩，谢谢。
  我们不封闭的，标准的WB程序应该是封闭的，但是我们实验室延续下来的是一抗二抗都用封闭液配制，1%BSA或者5%milk。
  程序没错，我知道是杂完抗体后洗膜，我说的那次洗膜，是有人说为了洗去转膜液，而我一般是在PBST里刷一下就放到一抗内，不知道这与我有个蛋白做不出来是否有关？
  关于封闭我也很困惑，是不是不好出的蛋白不应该封闭呢？

• daod (2014-1-24 22:30:49)

  
  是的 如果WB效果不好 可以考虑不封闭
  先封闭 背景会漂亮一点
  封闭液的成分和抗体稀释液差不多 呵呵 也算封闭了
  大家可以经常换换实验条件玩玩 有意外收获
  不过设计好的系列性的实验 需要把实验方法 操作全部固定下来 不可以做任何改动

• greenbee (2014-1-24 22:31:15)

  
  最好封闭一下，而且封闭时间最好长一点，我做了两次，封闭时间都比较短，最后曝光出来背景都很高

• xue258 (2014-1-24 22:32:00)

  
  恩，不同的蛋白应该不一样吧？
  我也不知道，昨天心血来潮室温封闭了一小时，居然连平时最容易出的蛋白都没曝出来。可惜当时没做内参，也不知道是不是显色液滴多了，一片白，一抗二抗的滴度都跟以前一样的。

• bling (2014-1-24 22:34:35)

  
  还是要多做几次摸摸条件，每个抗体特性还是差别大！

• sunnyB (2014-1-24 22:35:09)

  
  我们一般是洗三次，每次5分钟

• ALALA (2014-1-24 22:36:41)

  
  如果封闭液失效的话背景会很浓很乱，基本不可接受，于定量大有问题。
  我们这里都是用BSA配置一抗， 封闭液用5%脱脂牛奶。
  我个人不推荐用封闭液配置一抗
  一般脱脂牛奶封闭液，最多3次就会失效。而你的一抗其实可以用8~10次都可以。这样当封闭液失效后你的抗体就浪费了 ，这样非常浪费资源，除非你的实验室钱多得用不完。

• tudou85 (2014-1-24 22:37:14)

  
  个人认为洗膜>5分钟应该换漂洗液，1h已经失去洗膜的意义。而蛋白印迹到膜上是非共价键结合的，那么久只会影响印迹上的蛋白。实验的确要具体问题具体分析。我的建议是，封闭液还是要用的，但不必用5%，我每次都是配好5%脱脂奶，大家一起用，自己为了方便会在此基础上随便稀释一下，没有去定浓度的，但知道是<3%的即可，因我的蛋白也不好出，这样做可以保证背景(我的是单抗，但是不封闭背景很高的)，条带出来后再优化条件。不是必须用封闭液配抗体的，我是用TBST配的。再转膜及封闭后我都会常规TBS洗2～3分钟，给后续一个干净的环境，不会影响你的封闭效果的。对于洗膜，我是TBST 5m×2+TBS 5m×1或2，因吐温会影响抗体的结合，在抗体或ECL孵育前我都是用TBS漂洗的。个人观点，一起等待高手补充和指正！